慢病毒论文：人膜联蛋白 A10 基因过表达慢病毒的构建及其对人肝癌细胞株HepG2体外效应的研究【中文摘要】 1、构建人膜联蛋白A10基因(annexinA10, human, ANXA10)和增强绿色荧光蛋白 (Enhance green fluorescence protein,EGFP) 融合基因的重组慢病毒； 2、通过检测重组慢病毒对人肝癌细胞株 HepG2凋亡、增殖的影响及其对HepG2细胞中基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达的影响。初步阐明膜联蛋白 A10基因在人肝癌增殖、凋亡及转移中的作用。方法：1、针对已经筛选确定的ANXA10基因并将基因克隆转入到慢病毒载体表达质粒 PGC-Fu中, 通过酶切、测序验证ANXA10基因后 , 将PGC-Fu-ANXA10质粒和包装质粒pHdper1.0、pHelper2.0 共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞, 获得携带 ANXA10基因和 GFP基因的重组慢病毒 PGC-Fu-ANXA10。2、体外实验中 , 将上述慢病毒以最适MOI转染人肝癌细胞株HepG2,分成 ANXA10-慢病毒组、慢病毒空载组和HepG2细胞未转染组。荧光显微镜观察GFP表达以确定转染效率 , 采用 RT-PCR在 mRNA水平检测 ANXA10基因表达的变化 , 采用 Western blotting在蛋白质水平检测ANXA10基因表达的变化 , 以明确 ANXA10对人肝癌细胞株 HepG2的抑制作用 , 通过流式细胞技术及MTT法测定其对人肝癌细胞株HepG2凋亡及增殖情况 , 并运用同样的方法分别从mRNA和／或蛋白质水平检测MMP9、VEGF表达的变化。结果： 1、成功构建人 ANXA10基因过表达慢病毒 , 测序验证序列正确 , 经包装产生的病毒滴度为 2E+8。2、人 ANXA10基因过表达慢病毒高效转染人肝癌细胞株 HepG2,在转染后 3-4d GFP接近高峰 , 转染率达 70%。MOI值=10 是最适的 MOI值, 加 polybrene 使其终浓度为 5μ g/ml, 转染效果更佳。 3、人 ANXA10基因过表达慢病毒高效转染人肝癌细胞株HepG2 72h 后的增殖情况分析 ,ANXA10-慢病毒组于转染 72h 后 HepG2细胞的体外增殖抑制率达24.646%,与慢病毒空载组和HepG2细胞未转染组比较差异有统计学意义 (P0.05) ；凋亡实验显示 ,ANXA10-慢病毒组细胞凋亡率为 51.92 ±1.41%,慢病毒空载组细胞凋亡率为19.00 ±1.12%,HepG2细胞未转染组细胞凋亡率为3.59 ±0.89%,ANXA10-慢病毒组明显高于慢病毒空载组和HepG2细胞未转染组 (P<0.05) 。4、转染 HepG2细胞后 , 采用半定量 RT-PCR技...
