三代DNA测序技术之比较第一代测序技术：Sanger测序法第二代测序技术：454测序……第三代测序技术：？直接测序法：？1第1页，共65页。第一代测序技术：Sanger测序法——简便、快速2第2页，共65页。逐渐被遗忘的测序技术：Maxam-Gilbert的DNA化学降解法3第3页，共65页。Sanger测序的局限通过几十年的改进，第1代测序仪的读长可以超过1000bp，原始数据的准确率可以高达99.999%，测定每千碱基序列的成本是0.5美元,每天的数据通量可以达到60万碱基。但是，不管怎么改进，第1代测序技术在速度和成本方面都已达到了极限（因为对电泳分离技术的依赖,使其难以进一步提升分析的速度和提高并行化程度，并且难以通过微型化降低测序成本）。在此种情况下，第二代测序技术（Next-generationsequencing)应运而生。4第4页，共65页。概要•主要的测序平台•基因组分析原理•转录组分析原理•分析策略的选择第5页，共65页。第二代测序技术454测序IlluminaSOLIDPolonatorCompleteGenomics……6第6页，共65页。4547第7页，共65页。SOLID8第8页，共65页。Illumina9第9页，共65页。其他PolonatorCompleteGenomics……10第10页，共65页。11第11页，共65页。第二代测序技术的共同点1将目标DNA剪切为小片段2单个小片段DNA分子结合到固相表面3单分子独立扩增4每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号5高分辨率的成像系统。12第12页，共65页。第二代测序技术的局限与第一代测序仪相比，以合成测序为基础的下一代测序平台速度显著提高，成本明显降低。每台设备每天产出千兆碱基的序列不足为奇。但是,除了罗氏的454平台之外，读长短成了下一代测序平台的致命伤，这主要是由于DNA簇中存在的光学信号移相造成的。而应运而生的单分子测序技术是解决这一问题的一种方法。13第13页，共65页。第三代测序技术：单分子测序HelicosBiosciencesVisiGenPacificBiosciencesMobiousNexusI……14第14页，共65页。15第15页，共65页。直接测序法在所有上述三代测序技术中，序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下，通过读取DNA聚合酶或DNA连接酶将碱基连接到DNA链上过程中释放出的光学信号而间接确定的。除了需要昂贵的光学监测系统，还要记录、存储并分析大量的光学图像，这都使仪器的复杂性和成本增加。依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用，在目前测序成本中比例相当大。直接读取序列信息，不使用化学试剂，对于进一步降低测序成本是非常可取的。为了实现这样的目标，目前就有很多人在研究纳米物理技术。在全球，许多公司和组织，如Agilent，DNAElectronics，IBM,NabSys，OxfordNanoporeTechnologies，Sequenom等都在进行纳米孔测序的开发，不同的只是采用的方法或策略。16第16页，共65页。17第17页，共65页。18第18页，共65页。Secondgenerationsequence•Roche454MetagenomicsDenovosequencingRNA-seqillumiaSolexaDenovosequencingRe-sequencingRNA-seq(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)Meth-seqABISOLiDRe-sequencingChIP-seqRNA-seq第19页，共65页。Experiments•DNA-seq:denovo,resequencing•RNA-seq:mRNA,ncRNA,smRNA...•ChIP-seq:ChromatinImmunoPrecipitation•Methyl-seq:methylatedDNA(epigenome)第20页，共65页。•主要的测序平台•基因组分析原理•转录组分析原理•分析策略的选择第21页，共65页。SequencingGlossary•Reads.Acollectionofclonesthatover-samplethetargetgenome.•Pair-endreads.Sequencereadsderivedfrombothendsofasequencing-libraryclone.•Mate-pairreads.Sequencereadsderivedfrombothendsofamate-pairlibraryclonewhichinsertsizeisusually>1kb.•Insertsize.Thesizeoftheclone-insertfromwhichaclone-endpairistaken.•Contig.Theresultofjoininganoverlappingcollectionofsequencereads.•Scaffold.Theresultofconnectiingnon-overlappingcontigesbyusingpir-endreads.•N50size.Asappliedtocontigsorscaffolds,thatsizeabovewhich50%odtheassembled第22页，共65页。第23页，共65页。第24页，共65页。第25页，共65页。全基因组denove分析工具第26页，共65页...
