第十章酶的定向进化第一节定向进化简介第二节定向进化的应用第一节定向进化简介一、自然进化与定向进化二、理论来源三、概念四、定向进化的选择策略一、自然进化与定向进化达尔文在《物种起源》中提出以自然选择为基础的进化学说，成为生物学史上的一个转折点。1、自然进化（1）环境压力下物种朝着适应生存环境的方向发展；（2）漫长时间里通过DNA复制发生突变或通过重组，产生了遗传多样性；（3）自发、非常缓慢、自然选择；2、定向进化在实验室中模仿自然进化的关键步骤（突变、重组和筛选），在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效改造蛋白质，使之适于人类的需要。人为引发、较短时间、人为选择。3、定向进化的一般过程细菌诱变500C培养突变体库选择压力（温度）温度耐受型突变体最适生长温度为370C4、酶定向进化的意义酶作为生物催化剂其专一性和高效性是一般催化剂所不能比拟的，但是天然酶的许多性质不适应工业生产的条件。选择特殊环境，利用酶定向进化技术重新设计及改进酶分子的结构和性质，可以逐步接近和满足将酶催化用于工业生产的需要。二、理论来源利用基因工程原理在实验室中模拟生物进化过程待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用TaqDNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。化学进化生物进化是蛋白质工程的新策略主要是利用分子生物学手段，在分子水平创造分子的多样性，在事先不了解酶的空间结构和催化机制的情况下，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。是一种在生物体体外快速模拟达尔文进化的、具有一定目的性和快速改造蛋白质的方法，相对于传统的蛋白质的“理性设计”，酶的分子定向进化属于蛋白质的非合理设计。三、定向进化概念定向进化=随机突变+正向重组+选择（或筛选）定向进化的过程（1）通过随机突变和(或)基因体外重组创造基因多样性；（2）导入适当载体后构建突变文库；（3）通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。这个过程可重复循环，直至得到预期性状的酶。四、定向进化的选择策略随机突变策略易错PCR、DNA改组和外显子改组、体外随机引发重组、交错延伸、定位诱变筛选——采用回交法1、易错PCR(error-pronePCR)通过改变PCR反应条件，使扩增的基因出现少量碱基错配，从而导致目的基因的随机突变。控制DNA的突变频率。不足之处：靶序列长度一般在0.5-1.0kb，应用范围有限；中性突变较多；且较为耗时、费力获得的DNA序列中碱基的转换高于颠换。此法突变具有一定的密码偏向性。连续易错PCR(Sequentialerror-pronePCR)将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复进行随机诱变，使得每一次获得的少量突变累积而产生重要的有益突变。2、DNA改组1994年，Stemmer在Nature发表了一篇题为《RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling》的文章，首次提出了DNA改组(DNAshuffling)技术。Stemmer以β-内酰胺酶系统为试验对象，用DNA改组，经过三轮筛选和两次回交得到一新菌株，其头孢噻肟(Cefotaxime)的最低抑制浓度比原始菌株提高了32,000倍，也远高于易错PCR的突变筛选结果。DNA改组是DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上有性重组。通过改变单个基因(或基因家族)原有核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。是一种分子水平上的定向进化。因此也称为分子育种。DNA改组的效果必须由改组后的基因表达产物的功能来验证。因此，灵敏可靠的筛选方法是DNA改组技术成功与否的关键。DNA改组原理1.DNaseI产生随机片段；2.随机片段变性；3.随机片段复性；4.延伸反复重复步后，可获得全长DNA片段2-4。DNA改组步骤：（1）目的DNA片段的获得；（2）目的基因的随机片段化，即将目的基因（可以是单个基因或一组相关基因）酶切成随机片段，这些随机片段集合包含了来自不同的同源序列的寡核苷酸，这些寡核苷酸具有不同的...
