第十章酶的定向进化VIP专享VIP免费

第十章酶的定向进化第一节定向进化简介第二节定向进化的应用第一节定向进化简介一、自然进化与定向进化二、理论来源三、概念四、定向进化的选择策略一、自然进化与定向进化达尔文在《物种起源》中提出以自然选择为基础的进化学说，成为生物学史上的一个转折点。1、自然进化（1）环境压力下物种朝着适应生存环境的方向发展；（2）漫长时间里通过DNA复制发生突变或通过重组，产生了遗传多样性；（3）自发、非常缓慢、自然选择；2、定向进化在实验室中模仿自然进化的关键步骤（突变、重组和筛选），在较短时间内完成漫长的自然进化过程，有效改造蛋白质，使之适于人类的需要。人为引发、较短时间、人为选择。3、定向进化的一般过程细菌诱变500C培养突变体库选择压力（温度）温度耐受型突变体最适生长温度为370C4、酶定向进化的意义酶作为生物催化剂其专一性和高效性是一般催化剂所不能比拟的，但是天然酶的许多性质不适应工业生产的条件。选择特殊环境，利用酶定向进化技术重新设计及改进酶分子的结构和性质，可以逐步接近和满足将酶催化用于工业生产的需要。二、理论来源利用基因工程原理在实验室中模拟生物进化过程待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用TaqDNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。化学进化生物进化是蛋白质工程的新策略主要是利用分子生物学手段，在分子水平创造分子的多样性，在事先不了解酶的空间结构和催化机制的情况下，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。是一种在生物体体外快速模拟达尔文进化的、具有一定目的性和快速改造蛋白质的方法，相对于传统的蛋白质的“理性设计”，酶的分子定向进化属于蛋白质的非合理设计。三、定向进化概念定向进化=随机突变+正向重组+选择（或筛选）定向进化的过程（1）通过随机突变和(或)基因体外重组创造基因多样性；（2）导入适当载体后构建突变文库；（3）通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。这个过程可重复循环，直至得到预期性状的酶。四、定向进化的选择策略随机突变策略易错PCR、DNA改组和外显子改组、体外随机引发重组、交错延伸、定位诱变筛选——采用回交法1、易错PCR(error-pronePCR)通过改变PCR反应条件，使扩增的基因出现少量碱基错配，从而导致目的基因的随机突变。控制DNA的突变频率。不足之处：靶序列长度一般在0.5-1.0kb，应用范围有限；中性突变较多；且较为耗时、费力获得的DNA序列中碱基的转换高于颠换。此法突变具有一定的密码偏向性。连续易错PCR(Sequentialerror-pronePCR)将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复进行随机诱变，使得每一次获得的少量突变累积而产生重要的有益突变。2、DNA改组1994年，Stemmer在Nature发表了一篇题为《RapidevolutionofaproteininvitrobyDNAshuffling》的文章，首次提出了DNA改组(DNAshuffling)技术。Stemmer以β-内酰胺酶系统为试验对象，用DNA改组，经过三轮筛选和两次回交得到一新菌株，其头孢噻肟(Cefotaxime)的最低抑制浓度比原始菌株提高了32,000倍，也远高于易错PCR的突变筛选结果。DNA改组是DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上有性重组。通过改变单个基因(或基因家族)原有核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。是一种分子水平上的定向进化。因此也称为分子育种。DNA改组的效果必须由改组后的基因表达产物的功能来验证。因此，灵敏可靠的筛选方法是DNA改组技术成功与否的关键。DNA改组原理1.DNaseI产生随机片段；2.随机片段变性；3.随机片段复性；4.延伸反复重复步后，可获得全长DNA片段2-4。DNA改组步骤：（1）目的DNA片段的获得；（2）目的基因的随机片段化，即将目的基因（可以是单个基因或一组相关基因）酶切成随机片段，这些随机片段集合包含了来自不同的同源序列的寡核苷酸，这些寡核苷酸具有不同的...