定量PCR基本原理及方法VIP免费

定量PCR基本原理及方法基因有限公司黄妤一．荧光定量PCR基本原理二．荧光定量PCR标记方法三．荧光定量PCR不同方法学的应用内容定量PCR技术的产生1992年由Higuchi等人第一次报告：使用EB加入PCR反应体系，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度核酸↔染料荧光后来用与双链DNA有更强结合力的SYBRGreenI取代EB一．荧光定量PCR基本原理Real-timeChemistriesPCR的理论方程：Y=x×(1+Ev)nY：扩增物数量；X：起始模板数量；Ev：扩增效率；n：扩增循环数1.终点法定量原理前提：在最佳实验、循环次数n一定、Ev相同原理：根据扩增产物的量计数反应物中原始分子数，即：lnx=lnY-n×ln(1+Ev)=lnY-b(b为常数)2.实时检测法定量原理前提：在最佳实验、相同Ev以、扩增产物量相同原理：反应物中原始分子数（X）与其所需要的扩增循环次数（n）成反比，由此计算出标本中靶分子的准确含量，即：LgX=LgY–n×Lg(1+Ev)=b-n×a(a、b为常数)荧光定量PCR的定量原理阈值：PCR扩增信号进入相对稳定的对数增长期时的荧光值。阈值（threshold）的设定PCRefficiency=[10(-1/slope)]-1Whereslope=1/mSlope-3.322100%efficiencyPCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。Ct值——n：扩增循环数n:扩增循环数的确定logN=logN0+nlogEn=Ct每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，根据未知样品的Ct值，即可计算出该样品的起始拷贝数。Ct值与起始模板的关系Y轴—Ct值X—起始拷贝数的对数标准曲线•由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线•计算待测样品的初始模板浓度logN0=-CtlogE+logN绝对定量——未知浓度的样品与标准曲线相比较内掺式染料SYBRGreenI,LCGreen序列特异性探针TaqmanMolecularBeaconsFRET引物特异性探针Amplifluor(Intergen)LUX二．荧光定量PCR标记方法5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmission内掺式染料内掺式染料SYBR-GreenISYBR-GreenI5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission内掺式染料内掺式染料SYBR-GreenSYBR-GreenIIRQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation双标记探针双标记探针（（TaqmanProbeTaqmanProbe））RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信标分子信标（（MolecularBeaconProbeMolecularBeaconProbe））Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer荧光共振能量传递荧光共振能量传递（（FRETProbeFRETProbe））三．荧光定量PCR不同方法学的应用研究目的标记方法定量分析（基因拷贝数的绝对定量，基因表达调控的相对定量）Sybr-Green(LCGreen),Taqman,MolecularBeacon,etc研究目的基因型分析（SNP、突变型分析）Taqman,MolecularBeacon,FRET,LCGreen熔解曲线分析Sybr-Green,LCGreen,MolecularBeacon,FRET某科研用户使用Rotor-Gene3000进行基因表达检测结果（自备标准品，检测样品做复管）绝对定量某科研用户使用Rotor-Gene3000进行基因表达相对定量分析，下图为用∆∆Ct法得出的分析结果。（自备标准品，检测样品做3次重复复管）HouseKeeperGeneGeneofInterest相对定量利用溶解曲线进行实验条件的优化（RG3000）熔解曲线分析deg.737475767778798081828384858687888990919293949596979899100dF/dT.35.3.25.2.15.1.05BinABinBAnnealingat60℃deg.737475767778798081828384858687888990919293949596979899100dF/dT1.21.11.9.8.7.6.5.4.3.2.10BinAAnnealingat63℃标记方法Taqman定量分析，基因型分析Sybr-Green定量分析，熔解曲线分析，基因型分析(LCGreen)MolecularBeacon定量分析，熔解曲线分析，基因型分析FRET定量分析，熔解曲线分析，基因型分析AmpliflourProbe，LUX定量分析基因型分析利用扩增信号的种类来分型——Taqman根据熔解曲线的不同来分型——FRET,MolecularBeaconLCGreen双Taqman探针法检测野生型和突变型在基因型分析中，可采用两种不同的Taqman探针（分别针对野...