聚合酶链反应技术PCRVIP免费

聚合酶链反应技术（聚合酶链反应技术（PCPCRR））2009.82009.8•PCR具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。•Mullis1993年度诺贝尔化学奖。•PCR技术是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片段高效扩增的技术，可检出微量靶序列（1个copy）。在模板DNA、引物和dNTP存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。•仅需用极少量模板，在一对引物介导下，在数小时内可扩增至100-200万copy.PCR(PolymeraseChainReaction)Threesteps:denaturation,primerannealing,polymerization.PCR反应分三步：变性、退火及延伸。•PCR技术的基本原理其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。•①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；•②模板DNA与引物的退火：模板DNA变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补配对结合；•③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4min，2～3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。•标准的PCR反应体系：•10×Buffer10uldNTPmixtureper200umol/Lprimersper10～100pmoltempleteDNA0.1～2ugDNApolymerase2.5ulMg2+1.5mmol/LdH2O100ul•PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+•引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度(c)(c)(b)(b)引物引物225’5’3’3’3’3’3’3’5’5’5’5’((d)d)新引物新引物5’5’3’3’靶靶DNADNA的扩增的扩增(a)(a)5’5’3’3’引物引物113’3’5’5’3’3’5’5’引物引物22互补链互补链引物引物11互补链互补链单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链55’’33’’3’3’5’5’引物引物11互补链互补链引物引物22互补链互补链目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图(e)(e)(f)(f)(g)(g)温度温度（（℃）℃）时间（时间（miminn））9494727260609494℃℃变性变性（（1min1min））6060℃℃退火退火（（1min1min））7272℃℃延伸延伸（（1.5mi1.5minn））循环循环11循环循环22循环循环33PCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期PCRPCR反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNADNA变性、变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是反应参数是94℃94℃变性变性1min1min，，60℃60℃退火退火1min1min，，72℃72℃延伸延伸1.5min1.5min。如此周而复始，重复进行，直。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。至扩增产物的数量满足实验需求为止。PCRPCR应用应用遗传性疾病地中海贫血的基因诊断血友病苯丙酮尿症传染性疾病传染性疾病肝炎性病肿瘤法医学法医学个人识别、亲子鉴定1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。有时犯罪物证量很少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。植物遗传育种植物遗传育种构建遗传图谱、分离目的基因、基因定位分子标记辅助育种了解不同品种间的亲缘关系、系统进化畜牧畜牧畜禽病诊断:猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒性腹泻、免疫缺陷病毒等检测性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异DNA片段...