荧光定量荧光定量PCRPCR检测项目检测项目HBV-DNAHBV-DNA定量定量乙肝基因分型乙肝基因分型乙肝拉米夫定耐药乙肝拉米夫定耐药HCV-RNAHCV-RNA定量定量病毒性脑炎病毒性脑炎实时荧光定量PCR方法------TaqMan法方法：方法：TaqMan法TaqMan---水解型杂交探针与目标序列互补5′端标记有荧光报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针5’3’5’5’3’5’ForwardPrimerReversePrimerTaqMan®ProbeRQTaqman实时PCR的反应过程Taqman实时PCR的反应过程DisplacementDisplacement5’3’5’5’3’5’ForwardPrimerReversePrimerRQHydrolysisHydrolysis5’3’5’5’3’5’QRPolymerizationCompletedPolymerizationCompleted5’3’5’5’3’5’RQ每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法实时荧光定量PCR原理实时原理•常规PCR技术：•对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析•无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测•实时定量PCR技术：•利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析实时荧光定量PCR原理定量原理如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值扩增曲线扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件荧光阈值荧光信号阈值（threshold）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99真正的信号:荧光信号超过域值Ct值Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)valueCt值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性定量原理•理想的PCR反应：•X=X0*2n•非理想的PCR反应：•X=X0(1+Ex)n•n：扩增反应的循环次数•X：第n次循环后的产物量•X0：初始模板量•Ex：扩增效率定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:logM=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量标准曲线模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量确定未知样品的确定未知样品的C(t)C(t)值值通过标准曲线由未知样品的通过标准曲线由未知样品的C(t)C(t)值推算出其初始量值推算出其初始量Sample绝对定量绝对定量25标本采集和运送标本采集和运送•血液标本血液标本：：用用2ml2ml真空采集管或真空采集管或1.5ml1.5ml高压灭菌离心管采集血液标本，血高压灭菌离心管采集血液标本，血标本采集后在标本采集后在22小时内送达实验室（小时内送达实验室（HCVHCV采用采用EDTAEDTA抗凝的血浆）。离心抗凝的血浆）。离心（检验单与标本一道）后用一次性吸管吸取血清或血浆加入经消毒的（检验单与标本一道）后用一次性吸管吸取血清或血浆加入经消毒的1.5ml1.5ml的离心管中。的离心管中。•脑脊液脑脊液：：由临床医生采集后放入消毒的试管中及时送检。由临床医生采集后放入消毒的试管中及时送检。用于临床标本采集的容器如试管或离心管，均应使用前高...
