实时荧光定量 PCR实时荧光定量 PCR 技术于 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司推出, 由于该技术不仅实现 yPCR 从定性到定量的飞跃,而且与常规 PCR 相比,它 具有特异性更强、有效解决 PCR 污染问题、自动化程度高等特点,目前已得 到广泛应用.本文试就其定量原理、方法及参照问题作一介绍.实时荧光定量 PCR 原理所谓实时荧光定量 PCR 技术,是指在 PCR 反响体系中参加荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个 PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法.1.Ct 值的定义在荧光定量 PCR 技术中,有一个很重要的概念一一 Ct 值.C 代表 Cycle,t 代表 threshold,Ct 值的含义是：每个反响管内的荧光信号到达设 定的域值时所经历的循环数〔如图 1 所示〕.图 1. Ct 值确实定2.荧光域值〔threshold〕的设定PCR 反响的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设 置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍,即:threshold - 10 ' SD^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^Hycle3.Ct 值与起始模板的关系研究说明,每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线 性关系⑴,起始拷贝数越多,Ct 值越小.利用起始拷贝数的标准品可 作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代 Ct 值〔如图 2 所示〕.因此,只要获得未知样品的 Ct 值,即可从标准曲线上计算出该样 品的起始拷贝数.图 2.荧光定量标准曲线荧光定量 PCR 所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料 现将其原理简述如下:4.荧光化学1）TaqMan 荧光探针：PCR 扩增时在参加一对引物的同时参加一个特异性的荧光探针,该探针为一 寡核昔酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团.探针完整 时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时,Taq 酶的 5'一 3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团别离,从 而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条 DNA 链,就有一个荧光分 子形成,实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步.如图 3 所示.图 3. TaqMan 荧光探针工作原理2）SYBR 荧光染料： 在 PCR 反响体系中,参加过量 SYBR 荧光染料,SYBR 荧光染料特异性地掺入DNA 双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧 光信号,从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步.二.内标在传统定量中的意义1 .几种...
