细 胞 培 养 操 作 指 南 1， 原 代 细 胞 培 养 原代培养需要严格要求：（1）取材时需要去除脂肪和坏死的组织(2)为减少对组织的损伤，需用锋利的器具(3)适度离心以去除用于解离的酶（4）由于原代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度。（5）营养丰富的培养基比单一的培养基更可取，如果要添加血清，胎牛血清比牛马的血清更好。(6)对于取材部位易于感染（如皮肤）应先用70%乙醇消毒，在无菌条件下切除组织，尽快转移入BSS 或培养基中。不要再培养室取材，因为动物可引入微生物污染。若必须推迟，可保存在4℃，72h。 1. 剪切组织 先将所取得的组织，用D-Hanks 或Hanks 液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除粘附的结缔组织等非培养所需组织。再次清洗后，用手术剪将组织剪成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3 大小。静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。 2. 消化分离 消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。 3. 培养 细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液将细胞数调整为2～5× 105 cells／m1，或实验所需密度。分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。置CO2 培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。一般 3～5d，原代培养细胞可以粘附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2 的新培养液，继续培养2～3 d 后换液，一般 7～14 d 可以长满瓶壁，进行传代。 注意事项： 1. 无菌操作 细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般是很难消除。 2. 培养液所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。 3. 小牛血清 小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关 键 性 作用。可选择多 种不同批 号 的小牛血清进行小样 分析 。一旦确 定某 一厂 家 的某 一批 号 小牛血清后，就 保 持应 用至 实验完 成 。 4. 胶原酶溶 液 必须新鲜 配 制 ，贮 存时间 过 长(即 使是-20℃低 温保 存)，也 将影 响 消化效 力 ，导 致 ...
