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转录组测序结题报告 1.mRNA 纯化: 抽提得到的总RNA 首先利用10U 的 DNaseI(Ambion,美国)在37℃消化1 小时;然后利用Micropoly (A)Pu ristTM mRNA pu rification kit(Ambion,美国),进行 mRNA 纯化:把 RNA 稀释到250μ l 的体积,按照 Kit 的操作步骤(Cat.No: 1919)进行;最后得到的mRNA 用100μ l 预热的THE 缓冲液洗脱,利用NanoDrop进行定量。 2.cDNA 合成: cDNA 合成是在 Ng 等 2005 年发表的方法基础上改进而成(文献 1,图 1)。第一链 cDNA 合成利用GsuI-oligo dT 作为反转录引物,10μ g 的mRNA 作为模板,用1000 单位的Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen,美国)在 42℃作用1 小时完成;随后利用NaIO4(Sigma,美国)氧化 mRNA 的5’帽子结构,并连接生物素;通过 Dynal M280 磁珠(Invitrogen ,美国)筛选连接了生物素的mRNA/cDNA,并通过碱裂解释放第一链 cDNA;然后通过 DNA ligase(TaKaRa,日本)在第一链 cDNA 的5’末端加上接头,然后通过 Ex Taq polymerase (TaKaRa,日本)合成第二链 cDNA。最后通过 GsuI 酶切去除 polyA 和 5’端接头。 图 1. 全长 cDNA 合成示意图 3.cDNA 测序: 合成的cDNA 利用超声仪(Fisher)打断到300-500bp 的范围,利用Ampure beads(Agencourt,美国)进行纯化。随后纯化的cDNA 利用TruSeqTM DNA XXmple Prep Kit – Set A (illumina,美国)制备文库,并利用TruSeq PE Cluster Kit (illumina,美国)进行扩增。最后在 illumina 机器上进行测序反应。 测序得到的数据统计见表 1. 表 1. Solexa 测序统计 样品 对照 1 2 Reads 数目(对) 5,500,000 10,254,848 11,160,428 Clean data 5,442,815(98.96%) 10,160,130(99.08%) 10,998,951(98.55%) 平均长度 100 100 100 5.EST 拼装: 利用trinity 进行拼装。共得到45,308 个 EST cluster(contigs)。具体拼装结果见表2 和图2。 表2. 拼装统计 样品 XX Contig 数目 45,308 Contig 平均长度 698 Contig 长度范围 201-16,169 图2. Contigs 长度分布(横坐标为基因长度分布,纵坐标为基因数量分布) 6.数据分析: 6.1 基因预测:采用EMBOSS 工具包(参考文献2)中的’GetORF’对拼装得到的contigs 进行基因预测,从不同contigs 中找到蛋白编码序列。 6.2 基因注释:...

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