转录组测序结题报告 1．mRNA 纯化： 抽提得到的总RNA 首先利用10U 的 DNaseI（Ambion，美国）在37℃消化1 小时；然后利用Micropoly (A)Pu ristTM mRNA pu rification kit（Ambion，美国），进行 mRNA 纯化：把 RNA 稀释到250μ l 的体积，按照 Kit 的操作步骤（Cat.No: 1919）进行；最后得到的mRNA 用100μ l 预热的THE 缓冲液洗脱，利用NanoDrop进行定量。 2．cDNA 合成： cDNA 合成是在 Ng 等 2005 年发表的方法基础上改进而成（文献 1，图 1）。第一链 cDNA 合成利用GsuI-oligo dT 作为反转录引物，10μ g 的mRNA 作为模板，用1000 单位的Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen，美国)在 42℃作用1 小时完成；随后利用NaIO4（Sigma，美国）氧化 mRNA 的5’帽子结构，并连接生物素；通过 Dynal M280 磁珠（Invitrogen ，美国）筛选连接了生物素的mRNA/cDNA，并通过碱裂解释放第一链 cDNA；然后通过 DNA ligase（TaKaRa，日本）在第一链 cDNA 的5’末端加上接头，然后通过 Ex Taq polymerase (TaKaRa，日本)合成第二链 cDNA。最后通过 GsuI 酶切去除 polyA 和 5’端接头。 图 1. 全长 cDNA 合成示意图 3．cDNA 测序： 合成的cDNA 利用超声仪（Fisher）打断到300-500bp 的范围，利用Ampure beads（Agencourt，美国）进行纯化。随后纯化的cDNA 利用TruSeqTM DNA XXmple Prep Kit – Set A (illumina，美国)制备文库，并利用TruSeq PE Cluster Kit (illumina，美国)进行扩增。最后在 illumina 机器上进行测序反应。 测序得到的数据统计见表 1. 表 1. Solexa 测序统计 样品 对照 1 2 Reads 数目(对) 5,500,000 10,254,848 11,160,428 Clean data 5,442,815（98.96%） 10,160,130（99.08%） 10,998,951（98.55%） 平均长度 100 100 100 5．EST 拼装： 利用trinity 进行拼装。共得到45,308 个 EST cluster(contigs)。具体拼装结果见表2 和图2。 表2. 拼装统计 样品 XX Contig 数目 45,308 Contig 平均长度 698 Contig 长度范围 201-16,169 图2. Contigs 长度分布(横坐标为基因长度分布，纵坐标为基因数量分布) 6．数据分析： 6.1 基因预测：采用EMBOSS 工具包(参考文献2)中的’GetORF’对拼装得到的contigs 进行基因预测，从不同contigs 中找到蛋白编码序列。 6.2 基因注释：...
