核酸分子杂交的原理和试验方法VIP免费

核酸分子杂交的原理和实验方法原理所谓 DNA 探针，实质上是一段已知的基因片段，应用这一基因片段即可与待测样品杂交。如果靶基因和探针的核苷酸序列相同，就可按碱基配对原则进行核酸分子杂交，从而达到检查样品基因的目的。在随机引物法标记反应液中，有随机合成的六聚体核昔酸(hexanucleotide)作为引物， dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和 D1G-11-dUTP 作为合成底物，以单链 DNA 作为模板， 在 Klenow 酶的作用下， 合成掺入地高辛的DNA 链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA 链杂交后，再通过免疫反应来进行检测。一般通过酶标抗地高辛抗体来检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检测采用过氧化物酶系统，DAB 显色。敏感性很高。可用于膜上杂交和原位杂交。操作程序(1) 随机引物标记操作程序如下：①用灭菌去离子蒸馏水稀释1μ g DNA 至总体积 16μ l。②DNA 热变性：把DNA 瓶置于沸水中，水浴10 分钟。然后，迅速地插入碎冰中3 分钟以上。③加 4μ l DIG Random Labeling Mix(高效 ),混匀后再离心2000/r.p.m ×5 分钟。④置 37℃反应至少120 分钟。时间越长，产量越高。延长反应时间至20 小时可明显增加地高辛标记DNA 的产量。应根据需要控制反应时间。⑤加入 2μ 1 10mM EDTA 以中止反应，对于原位杂交和膜上杂交反应来说，标记反应可告结束，上述反应液置-20℃保存至少一年以上。且可反复使用。可根据下表估计标记产量：DNA 模板量标记一小时标记二十小时10ng 45ng 600ng 30ng 130ng 1050ng 100ng 270ng 1500ng 300ng 450ng 2000ng 1000ng 850ng 2300ng 3000ng 1350ng 2650ng (2)核酸探针膜上杂交原理和操作（一）杂交总原则脱氧核苷酸通过磷酸二酯键缩合成长链构成DNA 的一级结构。 两条碱基互补的多核苷酸链按碱基配对原则形成双螺旋，构成DNA 的二级结构。 某些条件 (如酸碱、 有机溶剂、 加热)可使氢键断裂， DNA 双链打开成单链重新结合。所谓杂交，是具有一定互补顺序的核酸单链， DNA 单链仍然可与序列同源的单链按碱基互补原则结合成异源性双链的过程。（二）杂交膜的选择杂交膜可以选择硝酸纤维素膜和尼龙膜。硝酸纤维膜的优点在于本底较低，但只能用于显色性检测， 且不能用于重复杂交。尼龙膜分为带正电荷的膜和不带电荷的膜两种。带正电荷的尼龙膜对核酸结合力强，敏感性也较高。不带电荷的膜结合力低，相应敏感性也较低。尼龙膜的优点在于杂交用过的膜，...