W B 经验总结 来源于丁香园论坛,由张慧慧(长沙 湘雅附二)推荐 来 dxy 好多年了,这些年陆陆续续回复了一些帖子,可是回来回去,发现大家提的问题,还是那么几个,没有从根本上有所提高,确实出乎意料。看过很多总结经验的帖子,不知道该如何评价,要么抄书本,要么人云亦云,缺乏自己的东西,新手参考这些当然难获进益。实在受不了,这些混淆视听的东西,本人把这么多年的回复,略作整理完善拼凑成《WB 实战指南》,欢迎行家批评指正。 首先,摆摆自己的经验。鄙人做WB 有 8、9 年了,平均下来两天跑一张多的蛋白胶;文章嘛,凑数的单篇有上 24+,一作单篇15+(系国内完成;注:当年的 IF,现在逐年递减没个标准)。 其次,由于一些机缘的因素,在实验室WB 体系完善的过程中,很多靠自己摸索;说实话,碰了一鼻子灰,差不多能碰到的问题都经历了,因此我敢写这样一个咚咚给大家分享。 再次,我再强调一点,对我们这类人来说,实验结果的可靠、漂亮已经不算一个要求;如何缩短操作时间,使实验进行的更有效率也是我们所追求的,因此本文会针对两个普遍采用的却可以看成浪费时间的操作,Bradford 法蛋白定量和立春红染膜做专门批判,这在以前的WB 操作指南是绝无的,甚至叛离被视为经典的分子克隆。——可是,请记住,经典是人定的。 话不多废,开始: 样品制备: 变性条件——SDS LB 直接裂解: 用常温或者高温预热过(预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化,但容易遗忘,LB 久煮某些性质会改变)的 1*SDS LB(或者略高 1.5*)直接加到细胞或者组织上并煮样。通常6 孔板细胞80%以上密度,需200ul,其他按平板面积比类推。通常条件下,SDS LB 都是过量的(因此不一定要严格参考 SDS LB 稀释比);如果SDS LB 不够,样品核酸、蛋白浓度过高时,煮样后会发现 tip 吸不上来,非常粘、一砣一砣的,很容易堵住tip。这时候常规做法有两种,1. 再煮5min。常规煮样时间3-5min,样品过浓时就煮10min;2.如果10min 煮样后,仍然吸不起来,才适当增加SDS LB,继续煮;也可以对样品进行超声。煮样时间若过长,蛋白会凝固,此时以失去继续 WB 的意义,请丢弃(判断标准:出现明显的蛋白沉淀和水分层) 此方法的缺点,SDS LB 煮过的样品如果用来做IP,需要特殊方法,因此,这种制备方法制备的样品有使用局限。 非变性裂解法(不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了,其实类似) 裂解细胞请尽量冰上操作...