W B 经验总结 来源于丁香园论坛，由张慧慧（长沙 湘雅附二）推荐 来 dxy 好多年了，这些年陆陆续续回复了一些帖子，可是回来回去，发现大家提的问题，还是那么几个，没有从根本上有所提高，确实出乎意料。看过很多总结经验的帖子，不知道该如何评价，要么抄书本，要么人云亦云，缺乏自己的东西，新手参考这些当然难获进益。实在受不了，这些混淆视听的东西，本人把这么多年的回复，略作整理完善拼凑成《WB 实战指南》，欢迎行家批评指正。 首先，摆摆自己的经验。鄙人做WB 有 8、9 年了，平均下来两天跑一张多的蛋白胶；文章嘛，凑数的单篇有上 24+，一作单篇15+（系国内完成；注：当年的 IF，现在逐年递减没个标准）。 其次，由于一些机缘的因素，在实验室WB 体系完善的过程中，很多靠自己摸索；说实话，碰了一鼻子灰，差不多能碰到的问题都经历了，因此我敢写这样一个咚咚给大家分享。 再次，我再强调一点，对我们这类人来说，实验结果的可靠、漂亮已经不算一个要求；如何缩短操作时间，使实验进行的更有效率也是我们所追求的，因此本文会针对两个普遍采用的却可以看成浪费时间的操作，Bradford 法蛋白定量和立春红染膜做专门批判，这在以前的WB 操作指南是绝无的，甚至叛离被视为经典的分子克隆。——可是，请记住，经典是人定的。 话不多废，开始： 样品制备： 变性条件——SDS LB 直接裂解： 用常温或者高温预热过（预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遗忘，LB 久煮某些性质会改变）的 1*SDS LB（或者略高 1.5*）直接加到细胞或者组织上并煮样。通常6 孔板细胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面积比类推。通常条件下，SDS LB 都是过量的（因此不一定要严格参考 SDS LB 稀释比）；如果SDS LB 不够，样品核酸、蛋白浓度过高时，煮样后会发现 tip 吸不上来，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。这时候常规做法有两种，1. 再煮5min。常规煮样时间3-5min，样品过浓时就煮10min；2.如果10min 煮样后，仍然吸不起来，才适当增加SDS LB，继续煮；也可以对样品进行超声。煮样时间若过长，蛋白会凝固，此时以失去继续 WB 的意义，请丢弃（判断标准：出现明显的蛋白沉淀和水分层） 此方法的缺点，SDS LB 煮过的样品如果用来做IP，需要特殊方法，因此，这种制备方法制备的样品有使用局限。 非变性裂解法（不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了，其实类似） 裂解细胞请尽量冰上操作...
