层析技术在蛋白质纯化中的应用 概述 一． 层析技术的基本原理 各种层析法虽然实验机理和实验方法大相径庭，但基本原理却都一样。即在所有的层析法中，均存在固定相和流动相。 为了更方便阐明层析技术的基本原理，引入“有效分配系数”这一概念，这一概念指的是在一定的温度、压力和一定溶剂系统中，一种物质分配达到平衡时，物质在固定相中的总量与在流动相中的总量的比值。 层析技术的分离原理可用下图表示： 图一 层析技术的分离原理 将 1ml 含有32ug 的蛋白的样品加到柱子上面，占据了柱子的A 位置，假定该蛋白的“有效分配系数”为1，则平衡后，该蛋白在固定相和流动相中的量均为16ug；有1ml 流动相加到柱上，平衡后，有16ug 的样品被带到 B 位置；再有1ml 流动相加到柱上，B 位置上的蛋白将有8ug 到达 C 位置，而 A 位置上的蛋白也将有8ug 带到 B 位置，就呈现出 A 位置 8ug，B 位置 16ug，C 位置 8ug。依此类推，假定经过 5 次平衡后蛋白被分配到整个柱中，此时柱中的蛋白分配量为A 位置 2ug，B 位置 8 ug，C 位置 12 ug，D 位置 8 ug，E 位置 2 ug。这样在柱子中部就形成了一个浓度峰。如果该蛋白的有效分配系数大于 1，则浓度峰在柱子中部以上；有效分配系数小于 1，浓度峰在柱子中部以下。 当然，只经过 5 次平衡形成的浓度峰是比较平坦的，但不难想象，若经过成百上千次的平衡，那么浓度峰就将越来越尖锐，蛋白在柱子某一位置被富集起来，浓度越来越高，这就是层析技术的基本原理。 事实上，流动相是连续不断地加入到柱子上的，因此柱上的平衡是连续发生的，在一个正常工作的柱子上发生着上千次的平衡，所发生的平衡次数我们称为“理论塔板数”，“理论塔板数”越多，柱子的分离效果就越好。 为了提高层析的理论塔板系数，通常使用细长的层析柱；并尽可能的使用细颗粒的固定相，但过细的颗粒会影响流速；流动相经过固定相时的速度要慢一些，以使蛋白在两相中能够达到分配平衡。上样体积也应受到控制，上样体积越小，展开后形成的峰越集中，这也能提高分离效果。 图二 不同塔板数的分离效果 总结：由于样品中各组分在特定的固定相和流动相中分配系数的不同，致使它们通过柱子的速度有差异，分配系数小的组分先离开柱子，从而与分配系数大的组分分离；在层析柱上各组分的峰形则取决于理论塔数，增加理论塔数，组分间的分离效果就更为优越。 二．层析法的分类 1 ． 按照层...
