免疫荧光染色方法

免疫荧光染色方法选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原一抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20°C 下可保存一年而不改变其染色特性。标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。常用抗原物质的固定方法抗原物质固定剂固定条件(min)蛋白质抗原95%〜100%乙醇室温 3〜10酶、激素丙酮4C30免疫球蛋白四氯化碳病毒丙酮、四氯化碳、无水乙醇室温 5〜10或4C30〜60多糖、细菌等微火加热，甲醇、10%甲醛、丙酮室温 5〜10或 4C30〜60类脂(异10%甲醛，10%佛茂尔室温 3〜10嗜性抗原)(ForMol)固定后以冷的 0・01Mol/LpH7・4PBS 液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。染色分直接染色法与间接染色法。1．材料与试剂(1)荧光抗体，稀释至应用浓度。(2) 0.01Mol/LpH7・4PBS 液(3) 9 份优质甘油加 1 份 pH7・4PBS 液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。(4) 带盖方盘2．直接染色法(1) 将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37°C 感做 30min~45min。(2) PBS 冲洗 3 次，每次冲洗 3min,即 3x3,冲洗。(3) 蒸馏水冲洗。(4) 滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。2．间接染色法(1)检查抗原：①取固定标本，加已知的免疫血清，37C 孵育30min；②以 PBS 液 3x3,冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37C 孵育30min；④ PBS3x3’冲洗；⑤ H2O 冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。(2)检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定;② 滴加相应抗原液(按 1：100〜1：500 稀释),37°C 孵育 30min；③ PBS 液 3x3’冲洗；④加荧光抗体，37C 孵育 30min；⑤ PBS 液 3x3’冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。荧光显微镜所观察到的图象，主要以两个指标判断结果，一个是形态学特征；另一个是荧光的亮度，在结果的判定中，必须将二者结合起来，综合判定。荧光强度的表示方法如下：＋＋＋〜＋＋＋＋：荧光...