细胞自噬检测

细胞自噬的研究方法正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察， 因此， 必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：一、自噬诱导剂(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂） ：IMPase 抑制剂 （即 Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）(3) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）： Class I PI3K Pathway抑制剂(5) Rapamycin：mTOR 抑制剂(6) Xestospongin B/C：IP3R 阻滞剂二、自噬抑制剂(1) 3-Methyladenine（3-MA ）：（ Class III PI3K） hVps34 抑制剂(2) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂(3) Hydroxychloroquine（羟氯喹）： Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义 RNA干扰技术（ Knockdown ）、突变株筛选、外源基因导入等。三、自噬过程进行观察和检测细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：1、观察自噬体的形成由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状， 双层或多层膜， 有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1 ）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（ AV2 ）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV ）2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3 融合蛋白来示踪自噬形成由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring ）自噬形成，人们利用LC3 在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时， GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3 融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。3、利用 Western Blot检测 LC3-II/I 比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型LC3 （即 LC3-I ）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II ），因此， LC3-II/I 比值的大小可估计自噬水平的高低。（注意： LC3 抗体对 LC3-II 有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2 和 3 需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）4、检测长寿蛋白的批量降解：非特异5、MDC （Mon...