腺病毒包装注意事项VIP专享

在 293 细胞中大量扩增腺病毒一旦重组病毒已被纯化和鉴定，即可在293 细胞中进行大量扩增。本手册提供了递增培养规模和腺病毒感染周期的基本方法， 按这一方法最终得到的病毒量约为3×1011 ～3×1012 。由于一个细胞中所含的病毒颗粒为1000 ～10000 ，因此 1L 培养细胞可得到约5×1012 病毒颗粒。如果要把病毒用氯化铯梯度离心纯化，则必须至少3 ×108 的细胞，这样才能正确分辨出病毒带。对于蛋白表达，则根据需要可在任何一步扩增步骤中停止，离心沉淀细胞后按照适当的操作方法进行蛋白抽提(根据蛋白类型的不同抽提上清或细胞沉淀)。为优化时间进程，每个感染周期必须与下一次细胞扩增培养同步。如果由于各种原因不能同步，则必须将病毒冻存，直至下一次细胞培养开始后再融化病毒。注意每次扩增都将会剩下一些病毒，这些病毒先不必丢弃，以便下一步扩增失败时备用。每次扩增最好都用最低代的病毒颗粒，这样产生突变型病毒的可能性会大大降低。操作步骤：1 在 100mm 培养皿或 75cm2 培养瓶中加入 10ml DMEM5%培养 5×106293 细胞。2 取 0.5ul 首次扩增的病毒保存液， 加入 DMEM5% 至 1ml ，混匀，这样稀释得到的MOI 值约为 5。3 移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3 次， 37℃ CO2 孵箱中培养 90 分钟。4 加入 9ml DMEM5%。5 再培养 72 小时，这时在 10ml 溶液中大约有 5×109 ～5×1010 个病毒颗粒，进行MOI 测定以估计病毒颗粒。注：如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。收集细胞，600 ×g 离心 5 分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积(一般为原始体积的1/10 即 1ml) 病毒保存溶液重悬细胞。-200C /370C 冻融 3 次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。1 -20 ℃/37 ℃冻融 3 次。2 转入15ml 无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10 分钟，收集上清冻存于-20 ℃或-80 ℃。3 3 个 175cm2培养瓶中各加入107 293 细胞进行培养。4 将 3ml 细胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中，混匀。移去细胞培养液，每瓶小心加入5ml 混合液，十字形慢慢晃动混匀3 次， 370C 5%CO2 孵箱中培养 90 分钟。此时 MOI 值约为 25 。5 加入 DMEM5% 至 30ml 。6 再培养 48 ～72 小时。此时 10ml 培养液病毒量约为3×1010 ～3×1011 。若需要，进行 MOI 测定以估计病毒滴...