引物合成的详解
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11月 13日 引物合成的详解 1
引物是如何合成的
目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法
DNA合成仪有很多种, 主要都是由 ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少
亚磷酰胺三酯法合成 DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点
亚磷酰胺三酯法是将 DNA固定在固相载体上完成 DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的 3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过 3′→5′磷酸二酯键连接
第一步是将预先连接在固相载体 CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团 DMT，获得游离的 5′-羟基
第二步，合成 DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的 3′端被活化，5′-羟基仍然被 DMT保护，与溶液中游离的 5′-羟基发生缩合反应
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数 5′-羟基没有参加反应(少于 2%)，用乙酸酐和 1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上
再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团 DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去
合成过程中可以观察 TCA处理阶段的颜色判定合成效率
通过氨水高温处理，连接在 CPG上的引物被切下来，通过 OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用 C18浓缩,脱盐，沉淀
沉淀后的引物用
