引物合成的详解.txt这是一个禁忌相继崩溃的时代，没人拦得着你，只有你自己拦着自己，你的禁忌越多成就就越少。自卑有多种档次，最高档次的自卑表现为吹嘘自己干什么都是天才。11月 13日 引物合成的详解 1.引物是如何合成的？ 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由 ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。 亚磷酰胺三酯法合成 DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将 DNA固定在固相载体上完成 DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的 3′端向5′端合成的，相邻的核苷酸通过 3′→5′磷酸二酯键连接。 第一步是将预先连接在固相载体 CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团 DMT，获得游离的 5′-羟基。 第二步，合成 DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的 3′端被活化，5′-羟基仍然被 DMT保护，与溶液中游离的 5′-羟基发生缩合反应。 第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数 5′-羟基没有参加反应(少于 2%)，用乙酸酐和 1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。 第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团 DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察 TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理，连接在 CPG上的引物被切下来，通过 OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用 C18浓缩,脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定 OD260定量，根据定单要求分装。 2.引物纯化方式有哪些，如何选择？ ◆ C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对 DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通 PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。 ◆ OPC纯化： OPC纯化是根据 DNA保护基（DMTr基）和 Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的 DNA片段。OPC法纯化的 DNA纯度大于 ...
