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引物设计Primer5.0

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引物设计软件Primer5.0 的操作(以小鼠GAPDH 为例): 1、在 NCBI 上搜索该基因,选择 Nu cleotide,输入 MUSS GAPDH。 2、找到该基因,点击打开基因信息。 3、点击进入 CDS 选项。 4、找到编码区所在位置。在 origin 中,Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 5、打开 Primer Premier5.0 软件,File—New—DNA Sequence,将复制的序列拷贝进弹出的窗口(1)NewSequence 中。 6、点击窗口中 Primer,弹出窗口(2)Primer premier。 7、点击窗口(2)中 Search,出现窗口(3)Search Criteria,按照图中设置各参数。一般 PCR Product Size 可以在 80-300 范围设置。Primer length 为 20 加减 2bp。 8、在 Search Mode 中选中 Manu al,点击 Search Parameters,弹出窗口(4)Manu al Search Parameters。修改默认值中的 TM 为 59%-61%,GC 为 40%-60%,点 OK。 9、直接再点击弹出窗口(5)Search Progress 中的 OK。 10、 软件即开始自动搜索引物,搜索完成后,自动跳出结果窗口(6)Search Resu lt,搜索结果默认按照评分(Rating)排序,分值偏高的比较好。另外还有产物长度,Tm 值等信息。 11、 点击窗口(6)中的任何一个搜索结果,可以在Primer Premier 引物窗口中会出现该对引物的详细综合信息,包括上游引物和下游引物的序列和位置等。比如2 号引物的PCR 产物在220 至656 之间,点击S 出现正向引物的信息,点A 出现反向引物的信息,图中显示的是反向引物(AntiSense)的信息。 对于引物的序列,可以简单查看一下,避免出现下列情况:3’端不要以A 结尾,最好是G 或者 C,T 也可以;3’不要出现连续的3 个碱基相连的情况,比如GGG 或 CCC,否则容易引起错配;此窗口中需要着重查看的包括:Tm 应该在55~70 度之间,GC%应该在45%~55%间,上游引物和下游引物的Tm 值最好不要相差太多,大概在2 度以下较好。 该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息,包括,发卡,二聚体,引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色,表示存在该二级结构,点击该红色按钮,即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物,应该都不存在这些二级结构,即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物,分值再高出现错配不能用,其他二级结构可以适当放宽,根据情况决定。 12、 点击 Edit Primer 会出现窗口(7),在该窗口中可以选中引物序列并拷贝出来。 13、 严格来说引物确定后,还需要对于上游和下游引物分别进行 Blast 分析,一般来说,多少都会找到一些其他基因的同源序列,此时,可以对上游引物和下游引物的 blast结果进行对比分析,只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。 14、 引物可以让公司免费设计并合成。

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