引物设计软件Primer5.0 的操作（以小鼠GAPDH 为例）： 1、在 NCBI 上搜索该基因，选择 Nu cleotide，输入 MUSS GAPDH。 2、找到该基因，点击打开基因信息。 3、点击进入 CDS 选项。 4、找到编码区所在位置。在 origin 中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 5、打开 Primer Premier5.0 软件，File—New—DNA Sequence，将复制的序列拷贝进弹出的窗口(1)NewSequence 中。 6、点击窗口中 Primer，弹出窗口(2)Primer premier。 7、点击窗口(2)中 Search，出现窗口(3)Search Criteria，按照图中设置各参数。一般 PCR Product Size 可以在 80-300 范围设置。Primer length 为 20 加减 2bp。 8、在 Search Mode 中选中 Manu al，点击 Search Parameters，弹出窗口(4)Manu al Search Parameters。修改默认值中的 TM 为 59%-61%，GC 为 40%-60%，点 OK。 9、直接再点击弹出窗口(5)Search Progress 中的 OK。 10、 软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，自动跳出结果窗口(6)Search Resu lt，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，分值偏高的比较好。另外还有产物长度，Tm 值等信息。 11、 点击窗口(6)中的任何一个搜索结果，可以在Primer Premier 引物窗口中会出现该对引物的详细综合信息，包括上游引物和下游引物的序列和位置等。比如2 号引物的PCR 产物在220 至656 之间，点击S 出现正向引物的信息，点A 出现反向引物的信息，图中显示的是反向引物(AntiSense)的信息。 对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’端不要以A 结尾，最好是G 或者 C，T 也可以；3’不要出现连续的3 个碱基相连的情况，比如GGG 或 CCC，否则容易引起错配；此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在55～70 度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm 值最好不要相差太多，大概在2 度以下较好。 该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，分值再高出现错配不能用，其他二级结构可以适当放宽，根据情况决定。 12、 点击 Edit Primer 会出现窗口(7)，在该窗口中可以选中引物序列并拷贝出来。 13、 严格来说引物确定后，还需要对于上游和下游引物分别进行 Blast 分析，一般来说，多少都会找到一些其他基因的同源序列，此时，可以对上游引物和下游引物的 blast结果进行对比分析，只要没有交叉的其他基因的同源序列就可以。 14、 引物可以让公司免费设计并合成。
