primer premier 为 主 , primer express 为 辅 ( 针 对 探 针 ), Oligo 来 验 证 , BLAST 随 时 检 验 PCR 引物设计原则 PCR引 物 设 计 的 目 的 是 为 了 找 到 一 对 合 适 的 核 苷 酸 片 段 , 使 其 能 有 效 地 扩 增 模 板DNA序 列 。 因 此 , 引物 的 优 劣 直 接 关 系 到 PCR的 特 异 性 与 成 功 与 否 。 要 设 计 引 物 首 先 要 找 到 DNA序 列 的 保 守 区 。 同 时 应 预 测 将 要 扩 增 的 片 段 单 链 是 否 形 成 二 级 结 构 。 如 这 个区 域 单 链 能 形 成 二 级 结 构 , 就 要 避 开 它 。 如 这 一 段 不 能 形 成 二 级 结 构 , 那 就 可 以 在 这 一 区 域 设 计 引 物 。现 在 可 以 在 这 一 保 守 区 域 里 设 计 一 对 引 物 。 一 般 引 物 长 度 为 15~ 30碱 基 , 扩 增 片 段 长 度 为 100~ 600碱基 对 。 让 我 们 先 看 看 P1引 物 。 一 般 引 物 序 列 中 G+C 含 量 一 般 为 40%~ 60%。 而 且 四 种 碱 基 的 分 布 最 好 随机 。 不 要 有 聚 嘌 呤 或 聚 嘧 啶 存 在 。 否 则 P1引 物 设 计 的 就 不 合 理 。 应 重 新 寻 找 区 域 设 计 引 物 。 同 时 引 物 之间也不 能 有 互补性 , 一 般 一 对 引 物 间不 应 多于4 个 连续碱 基 的 互补。 引 物 确定以 后, 可 以 对 引 物 进行必要 的 修饰, 例如 可 以 在 引 物 的 5′端加酶切位点序 列 ;标记生物 素、荧光素、地 高辛等, 这 对 扩 增 的 特 异 性 影响不 大。 但3′端绝对 不 能 进行任何修饰, 因 为 引 物 的 延伸是从3′端开 始的 。 这 里 还需提醒的 是 3′端不 要 终止于密码子的 第3 位, 因 为 密码子第3 位易发生简并,会影响扩 增 的 特 异 性 与 效 率。 综上所述我 们 可 以 归纳十条PCR引 物 的 设 计 原则 : ① 引 物 应 用核 酸 系 列 保 守 区 内设 计 并具有 特 异 性 。 ② 产物 不 能 形 成 二 级 结 构 。 ③ 引 物 长 度 一 般 在 15~ 30碱...