成骨细胞的培养及骨折模型的制作青岛大学医学院阎春玲成骨细胞的培养可广泛应用于骨折及骨损伤的疾病研究中，同时为筛选新型药物和研究机制提供离体研究。原代培养细胞株成骨细胞的培养及检测原代培养成骨细胞的来源国内外文献报道新生动物的颅骨或胚胎颅骨为成骨细胞的常用来源。有不少学者尝试用新生大鼠的颅骨分离成骨细胞，结果表明所培养的成骨细胞具有典型的成骨细胞的形态特征、生物学活性及发生钙化的功能。有学者研究兔盖骨的成骨细胞增殖．代谢及钙化的能力发现，来自兔盖骨的成骨细胞具有较高的增殖能力，但碱性磷酸酶的生成较低，而且兔盖骨来源的成骨细胞在体外培养中可以形成有序的钙化结节和羟基磷灰石(HA)结晶。小鼠原代培养1.取新生3d以内BALB/c小鼠，断颈处死后立即投入75%酒精中消毒5min。2.D-Hank’s液漂洗后分离颅盖骨，刮除骨膜和结缔组织，DMEM清洗颅骨骨片并剪碎3.加入0.25%胰蛋白酶（含0.02EDTA），37°恒温消化20min，吸出消化液，之后1mg/1mlI型胶原酶37°恒温消化20min后离心（1000r/min，5min），弃上清液4.加入含15%血清的DMEN培养基，吹打骨片（力气不要过大，但要吹打次数多一下，尽量使细胞从松解得骨片上脱落），将细胞悬液接种于培养瓶中，置于37CO2℃恒温孵育箱中培养。传代培养步骤1.弃除旧的培养液（可以吸，可以倒，倒的时候小心）2.用PBS冲洗一遍（加PBS清洗或换液时，不要将细胞冲刷下来）3.用0.25%的胰酶消化液消化30-45s，在显微镜下观察，细部变圆，间距增大时，可用手拍打瓶侧壁与底壁，会发现细胞很快悬浮。4.加入含15%的牛血清培养液终止消化5.用吸管反复细心吹打瓶底，置离心管中后，可以用PBS或D-HANKS再吹打，可以反复几次，目的是将细胞尽可能的洗刷干净6.离心大鼠成骨细胞的培养将SD乳鼠置入75%酒精中浸泡5min。于超净台上取顶骨,放入PBS皿中,刮除附着组织,待骨质发白、透亮,再放入PBS小瓶反复冲洗,换液3次,以0.1%II型胶原酶消化30min后吸弃酶液,再以PBS冲洗3次，加入0.1%II型胶原酶,将骨剪成1mm2大小,放置15min后加入与酶液等量的含15%小牛血清的DMEM培养基,吸取上清液,以1000r/min离心10min,将下层液接种于50ml培养瓶,离心液去上清后接种于25ml培养瓶,分别加入上述培养基,置入37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内。每2日换液1次,待细胞长满后,用0.25%胰蛋白酶消化,按1∶2比例传代。1.成骨细胞的取材：新生SD大鼠的乳鼠新生24h-72h的乳鼠2.将去除血管及结缔组织的骨片放置在1mlPBS液体中（PBS不要放太多，否则延长剪碎时间），用剪刀剪成1*1mm的组织快，越小越好（越小越能消化完全），一只乳鼠的头盖骨加胰酶2ml，37℃水浴中消化30min（目的是消化掉附着骨片上的结缔组织），离心去酶，加入2ml胶原酶2，水浴中继续消化1h（中间间隔晃动，使消化下来的胶原离开团块溶于液体中）。如此消化下来的混悬液可能比较稠，可以加适量的PBS，尽量让胶原溶于液体中，否则不利于离心细胞沉降到离心管的底壁。3.培养基问题：低糖的DMEM培养基4.培养瓶培养瓶在接种前，使用1%多聚赖氨酸快速包被（具体方法：每个50ml培养瓶加3-4ml1%多聚赖氨酸，尽量是底壁均铺满液体，拧上盖子，放置30min，倒掉1%多聚赖氨酸液体，用去离子水或PBS液冲洗两遍），包被的培养瓶，细胞很容易贴壁。注意问题大鼠成骨细胞成骨细胞的鉴定形态学观察碱性磷酸酶染色(alkalinephosphatase，ALP)钙化结节染色细胞株MC3T3-E1（小鼠胚胎成骨细胞），MC3T3-E1Subclone14（小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14）MC3T3-E1细胞体外培养成骨细胞的影响因素物理因素1电离辐射单次低剂量辐射（40cGy以下）对大鼠成骨细胞样细胞不会引起明显的改变,而单次高剂量辐射（400cGy）却使克隆成骨细胞系MC3T3-E1的ALP活性增加.2微重力目前认为失重条件下骨形成受到抑制是造成骨质脱钙的主要原因，特别是成骨细胞数目的减少和活性的降低。3外力Hasegawa等将鼠成骨细胞培养在可变形塑料膜上，使膜均匀变形，发现机械拉伸能刺激成骨细胞增加DNA合成，适当的拉应变刺激，可使培养的细胞中DNA含量明显增加，还可导致成骨细胞的增殖变快。微量元素微量元素在骨的形...
