酶联免疫吸附剂测定ELISA试验报告及试验感想

ELISA 实 验 报 告实 验 名 称酶 联 免 疫 吸 附 剂 测 定 （ enzyme － linked immunosorbent assay，简 称 ELISA ）实 验 原 理ELISA是一种在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。基础 : 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物， 产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。此次实验采用间接法，是检测抗体最常用的方法。这一方法的基本原理是： ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高， 故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。实验试剂及器材1. 聚苯乙烯微量细胞培养板 (平板 , 96 孔)。2. 酶联免疫检测仪3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。4. 包被液：0.05 mol/L 碳酸缓冲液（ pH 9.6）：Na2CO30.15 克, NaHCO30.293 克，蒸馏水稀释至 100 毫升。5. 稀释液（ PBS-Tween）：NaCl 8 克, KCl 0.2克，KH2PO4 0.2 克, Na2HPO4· 12H2O 2.9g, 6. Tween-20，0.5ml ，蒸馏水加至 1000ml。7. 洗涤液：同稀释液。8. 封闭液： 0.5 % （质量分数） BSA（用 PBS 配制）。9. 邻苯二胺溶液 (底物)：配制： 0.1 mol/L 柠檬酸 (2.1 克/100 毫升)，取 6.1ml，0.2 mol/L Na2HPO4· 12H2O (7.163 克/100 毫升)，取 6.4ml, 加蒸馏水 12.5ml, 取邻苯二胺 8mg（溶解）；临用前加 30 % （体积分数） H2O240 微升。10. 终止液： 2 mol/L H 2SO4。实 验 步 骤1.向 培 养 板 中 加 入 经 过 包 被 液 稀 释 的 抗 原 ， 每 孔 加200微 升 , 37 ℃ 温 育 30min 。2.倒尽板孔中液体，加200 微升洗涤液，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。3.加封闭液 200 微升， 37 ℃...