DNA测序原理VIP专享VIP免费

第六章第六章DNADNA序列分析序列分析人类基因组计划人类基因组计划(humangenomepr(humangenomeproject,HGP)oject,HGP)人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。总体计划在15年内投入至少30亿美元进行人类全基因组的分析。美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与。我国承担其中1%的任务，即人类3号染色体短臂上约30亿个碱基的测序任务。人类基因组线粒体基因组核基因组(约30亿个碱基)基因外序列基因和基因有关序列约10%约90%专一或中等重复序列Non-codingDNA假基因内含子基因片段<10%>90%专一的或低拷贝数序列中度至高度重复序列20~30%70~80%分散重复序列串联重复序列/成簇重复序列约60%约40%蛋白编码基因rRNA基因tRNA基因CodingDNA序列测定的技术杂交测序法质谱法单分子测序法原子探针显微镜测序法DNA芯片法经典方法:Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977)Maxam-GilbertDNA化学降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技术方法:•与与PCRPCR反应类似。反应类似。•反应体系中包含：模板反应体系中包含：模板DNA,DNA,TaqTaq酶酶,dNTPs,ddNTPs,dNTPs,ddNTPs和和测序引物；测序引物；•反应过程：反应过程：变性－复性－延伸－终止变性－复性－延伸－终止Sanger双脱氧终止法DideoxynucleotidesDideoxynucleotides（双脱氧核苷酸）（双脱氧核苷酸）•ddNTPsddNTPs是反应终止剂是反应终止剂可以当作正常碱基参与复制，可以当作正常碱基参与复制，一旦链入一旦链入DNDNAA中，其后就不能再继续连接。中，其后就不能再继续连接。•反应体系中反应体系中dNTPsdNTPs的浓度远高于的浓度远高于ddNTPs(ddNTPs(一般一般3~3~44：：1)1)。。*少一个－OH少一个－OH脱氧核甘酸与双脱氧核甘酸结构比较HSangerSanger第一步：加入复制终止第一步：加入复制终止剂剂荧光检测探头电泳，看谁跑得快ddNTPsddNTPs参与下的参与下的DNADNA复制复制SangerSanger法测序产物的平均法测序产物的平均链长取决于链长取决于ddNTPddNTP与与dNdNTPTP的比例，比例高时，的比例，比例高时，得到较短的产物；得到较短的产物；GelElectrophoresisGelElectrophoresisDNAFragmentSizeDeterminationDNAFragmentSizeDetermination•DNADNA带负电带负电•DNADNA在电泳胶中的迁移率在电泳胶中的迁移率与其片段大小有关与其片段大小有关SangerSanger第二步：荧光检测第二步：荧光检测除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。Maxam-GilbertMaxam-Gilbert化学裂解法化学裂解法一个末端标记的一个末端标记的DNADNA片段在几组互相独立的的化学反片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记某一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的的DNADNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原在原DNADNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。测末端标记的分子。碱基特异性化学切割反应：碱基特异性化学切割反应：硫酸二甲酯（硫酸二甲酯（DMSDMS）：使）：使DNADNA分子中分子中鸟嘌呤（鸟嘌呤（GG）上的）上的NN77原子甲基化。原子甲基化。肼：使肼：使DNADNA分子中胸腺嘧啶（分子中胸腺嘧啶（TT）和胞）和胞嘧啶（嘧啶（CC）的嘧啶环断裂；但高盐条件）的嘧啶环断裂；但高盐条件下，只下，只CC断裂，而不与断裂，而不与TT反应。反应。哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切三种化学...