PCR的种类及应用VIP免费

PCR的种类及应用序10/23/20241第1页，共32页。PCR的历史操作过程引物步骤PCR的各种变体PCR的应用鉴定基因亲子鉴定诊断遗传病克隆基因诱变分析远古DNA鉴定特定表型的突变体基因比较基因表达量目录第2页，共32页。10/23/20243PCR这项技术是由凯利·穆利斯(KaryMullis)发明，并因此在七年之后，1993年10月，获得了诺贝尔化学奖该项殊荣。穆利斯的想法是，利用一种人工方法，和反复相同程序的方法，并利用一种特殊的酶——即DNA聚合酶来扩增特定的DNA片段。PCR历史第3页，共32页。10/23/2024DNA的复制DNA在复制时，双链DNA解旋成两股分别进行。其复制过程的复制起点呈现叉子的形式，故称复制叉。以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链为3’—〉5’走向，在其上DNA能以5’—〉3’方向连续合成，称为前导链(leadingstrand)；另一条模板链为5’—〉3’走向，在其上DNA也是5’—〉3’方向合成，但与复制叉移动的方向正好相反，故随着复制叉的移动形成许多不连续的冈崎片段，最后在连成一条完整的DNA链，该链称为后随链(laggingstrand)。第4页，共32页。10/23/20245①5’→3’的聚合作用：不是复制染色体而是修补DNA，填补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。②3’→5’的外切酶活性：消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。③5’→3’外切酶活性：切除受损伤的DNA，可用于切口平移（nicktranslation).大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是完整的DNA聚合酶Ⅰ的一个片段，只有在5’→3聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，失去了5’→3外切酶活性。它可用于填补DNA单链末端成为双链。DNA聚合酶第5页，共32页。TaqDNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是一种嗜热真菌，能在70-75℃生长.存在于水生嗜热菌(Thermusaquaticus)的嗜热DNA聚合酶，可在74℃复制DNA，在95℃仍具有酶活力。该酶可在离体条件下，以DNA为模板，延伸引物，合成双链DNA。这个酶只有5′→3′DNA聚合酶活性和5′→3′的外切酶活性，缺少3′→5′的外切酶活性。该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为94KDa.其比活性为200000单位/mg.75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒.温度过高(90℃以上)或过低(22℃)都可影响TaqDNA聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成，但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性.TaqDNA聚合酶第6页，共32页。10/23/20247PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增。它可以在试管里建立反应，经过数小时之后，就能将极微量的目的基因或者某一特定的DNA片段扩增数十万倍，乃至千百万倍，而无需通过繁琐费时的基因克隆程序，便可获得足够数量的精确的DNA拷贝，所以有人亦称为无细胞的分子克隆法。PCR的定义第7页，共32页。PCR操作过程1、预变性（Initialdenaturation）．模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。2、引物退火（Primerannealing）退火温度一般需要凭实验（经验）决定。退火温度对PCR的特异性有较大影响。3、引物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。延伸时间随扩增片段长短而定。4、循环中的变性步骤循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性：变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。5、循环数大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特炖条带6、最后延伸在最后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟．使引物延伸完全，并使单链产物退火成双链。第8页，共32页。引物设计设计引物可以采取以下原则：GC所占比例为40％－60％两个引物的Tm，相差小于5℃，并且扩增产物的Tm与引物的相差不超过10℃。黏合温度通常比计算的最低Tm低5℃，但是要根据经验为不同条件下的PCR选择不同的黏合温度。内部的具有自身互补性的发卡结构不超过4个，其二聚体中不超过8个。3‘末端尤其重要，必须不含有与其他引物互补的序列，并且要与模板完全互补。倒数第二个最好是G/C第9页，共32...