L 其位于启动（■、终 u止子之间宜选择凶其怖 F-円标记基因内不宜考点加强课 6 限制酶的选择与 n 的星因的检测展•探喘与鉴定1•限制酶的选择原则⑴ 根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类① 应选择切点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图甲可选择 PstI。② 不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，以防破坏目的基因，如图甲不能选择 SmaI。③ 为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用 PstI 和 EcoRI 两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点），而且这种切点不致于破坏所有的“标记基因”以及启动子和终止子。⑵ 根据质粒的特点确定限制酶的种类f-'J子之其会破坏心动子不宜选择其會破坏终止「不国梵垃干复制炽点内+复制條点披彼坏或切掉川斤能在受体细胞中复制保徉，而不宜选择此位点诩割会导致终」|：F 丢失不宜选择切点傥于 T-DNA切呎虽在切点不位于|：iM 丨 L 含兀亦 L.T-DNAL1-DNA©K 丨㈣聊切点怡但飲疋SacI占目的基内两城切点切点相同① 所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。② 质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，应至少含有一个完好的标记基因，如图乙中限制酶 pstI 因其会破坏标记基因而不宜选择。③ 所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点，如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。④ 所选限制酶，其切点应位于启动子与终止子之间，如图乙中 Hindlll 会破坏启动子，EcoRI 会破坏终止子，而 Ndel 和 BamHI 切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。⑶ 参考 Ti 质粒的 T-DNA 片段选择限制酶若质粒上标出 T-DNA 片段，则所选限制酶切点应位于 T-DNA 片段中，从而有利于将目的基因嵌入到 T-DNA 片段上——因为 Ti 质粒的 T-DNA 片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体 DNA 上,如用两种限制酶 XbaI 和 Sac1（两种酶切出的黏性末端不同）切割某 DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，则下图中甲、乙、丁，Ti 质粒均不宜选择，而丙 Ti质粒宜选取。（分析如下）2•目的基因的检测与鉴定⑴ 界定“标记基因”与“DNA 分子杂交技术”在目的基因检测中...
