PCR技术及其应用VIP免费

第六章PCR技术及其应用§1PCR技术原理§2PCR技术应用第一节第一节PCRPCR技术原理技术原理一、PCR技术简史•DNA的复制•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史•DNA的复制•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史•DNA的复制•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史•DNA的复制•聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史•DNA的复制•聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖KaryB.MullisKaryB.Mullis<>ofthePolymeraseChainReaction>>19891989年美国年美国《《ScienceScience》》杂志列杂志列PCRPCR为十余项重大科学为十余项重大科学发明之首发明之首,,比喻比喻19891989年为年为PCRPCR爆炸年爆炸年,Mullis,Mullis荣获荣获19931993年度诺贝尔化学奖。年度诺贝尔化学奖。引物引物MullisMullis的构思的构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定DNADNA片段片段72℃72℃9494℃55℃55℃PCRPCR循环循环二、PCR的基本原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95oC)TargetSequenceTargetSequencePCR原理示意图①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；PCRCycle-Step2–Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；PCRCycle-Step3-At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。Endofthe1stPCRCycle–ResultsintwocopiesoftargetsequenceTargetSequenceTargetSequence每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。TargetAmplificationNo.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon三、PCR反应•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点标准的PCR反应条件：10X缓冲液10μL4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5UMg2+1.5mmol/LPC...