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聚合酶链式反应(PCR)原理与相关技术一、PCR技术二、定量PCR技术三、数字PCR技术一、PCR原理PolymeraseChainReaction(PCR):在体外特异性地扩增某个基因。1、历史•1971年,Khorana提出体外人工复制DNA的设想。•1985年Cetus公司科学家K.B.Mullis使设想变成现实,采用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断(37℃),并获1993年诺贝尔化学奖。•1988年R.K.Saiki应用TaqDNA聚合酶(水生栖热菌)于PCR反应;同年,Cetus公司发明自动热循环仪。K.B.Mullis2、原理预变性-变性-退火-延伸-保存循环(30次)95℃预变性1min95℃变性1min目的:DNA双链成单链56℃退火目的:引物先与模板匹配72℃延伸1-2min目的:聚合酶在引物3’端加核苷酸,合成新链12℃保存循环特异性强、灵敏度高、快速、简便循环次数DNA数量1224382010485763010737418241、Taq酶:具有5’→3’聚合酶和外切酶活性,无3’→5’外切酶活性,不能修复错误的碱基配对,因此必须测序。需激活剂:Mg2+2、pfuDNA聚合酶:有5’→3’和3’→5外切酶活性,出错率最低,但PCR产物平端。3、TaqPlusDNA聚合酶:是Taq和pfu的混合物,TaqPCR产物3’端带-A。4、引物:互补;引物长度;3’碱基序列必须与模板配对;尽量提高GC含量;避免连续相同碱基排列或开成回纹结构;避免形成引物二聚体。5、Tm=(G+C)×4+(A+C)×26、primer5.07、模板纯度:不一定要纯,但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、Mg2+螯合剂等。模板量(100ng/100μl)8、dNTP浓度2.5mMeach特殊说明:普通PCRRT-PCRTAIL-PCRReal-timePCR数字PCRPCR类型:普通PCR仪梯度PCR仪原位PCR仪定量PCR仪数字PCR仪二、实时荧光定量PCR(Real-timequantificationPCR)1、历史实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它的特异性更强、更能有效解决PCR污染问题、自动化程度更高等特点。原理:在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料(如SYBRGREEN1)或特异性的荧光探针(如Taqman探针),利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程,再通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析的方法。也就是通过荧光的变化,获得不同样品达到一定荧光信号(阈值)所需要的循环次数Ct(CycleThreshold)。Ct值的含义:每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。1、荧光探针和荧光染料:分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物,前者特异性高,后者操作简单。SYBRGREEN1:结合双链DNA小沟后,荧光强度增强,但也会结合引物二聚体或单链引起的二级结构。变性时,双链分开,荧光消失。特别说明:TaqMan探针:寡核苷酸探针,荧光基团连接在5’端,淬灭基因连在3’端。5’端荧光基团吸收能量后转移给临近的3’端淬灭基团,发生共振能量转移(FRET),只要探针完整,能量就会被淬灭。荧光定量PCR的优点1.荧光信号的强弱可实时反映DNA的扩增;2.灵敏度极高,用于准确定量初始模板数量;3.既能用于定性,判断一段DNA序列的有无,也可用于定量,确定起始DNA拷贝数。一对引物引物之间一条寡核苷酸,即探针报告基因与淬灭基团完整探针,不发光;水解后,发光。FRET变性(95℃)退火(60℃)DNA聚合酶5’→3’外切酶活性;可将探针5’端的荧光基团切割下来。荧光基团游离下来后发光了!因为探针是完全与目的基因互补,当它被水解后就发光,因此发光的强度与目标基因量成正比。只与双链结合,发光;不与单链结合,不发光。随温度升高,DNA双螺旋结构降解程度的曲线即熔解曲线,可用对数图和线性图表示。在扩增产物的溶解温度上有一特征峰(Tm,DNA双链解链50%的温度),用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开,因为它们在不同的温度溶解。染料法做,探针法不做不适合染料法卤素灯(白光)定量线性图与对数图正好相反,基线期在对数图中增高。基线荧光阈值Ct值[DNA]0基线:扩增线中的水平部分,由环境的噪音产生。实验结束软件自动分析数据,基线取默认值3-15(循环数)。如果最小的Ct值>18,保持默认;如果最小的Ct值<18,基线终点改成[最小的Ct值减3],重新分析。荧光阈值:在荧光扩增曲...

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