PCR技术与应用VIP免费

PCR技术及其应用背景•由Khorana及其同事于1971年提出：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重视该过程便可克隆tRNA基因”。•但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时(1970年)Smith等发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘。•１９８３年，在Ｃｅｔｕｓ公司工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段ＤＮＡ的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州１０１号高速公路上，灵机一动想到了一个实际上可以无限扩增某段ＤＮＡ的简单方法，即ＰＣＲ。•在１９８５年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家中也引起了链反应。大家很快地纷纷采用这个方法，很多人还很奇怪自己怎么没有首先想到这么做。Ｃｅｔｕｓ给了Mullis一万美元的奖金，随后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。ＰＣＲ被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项技术突破。•１９９３年，KaryMullis因此获得诺贝尔化学奖。PCR只是一个简单的不起眼玩艺——凯利·穆利斯（KaryMullis)PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。…它最大的特点就是能不断推出新形式。——PaulRabinowPCR技术聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸（dNTP）存在的条件下，由耐热DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）在体外反复酶促合成双链DNA的反应称为聚合酶链式反应。#PCR反应五要素：●模板DNA：50-200ng，高纯度，增加反应特异性●PCR用引物：根据目的基因两侧特定序列设计。约20bp左右；Ｇ＋Ｃ含量在40-70％之间；内部不能有回文序列；３’端不能互补。●PCR用DNA聚合酶：嗜热杆菌、耐热95℃●PCR用Buffer：Mg2+是辅基（2.0mM）。浓度太低酶活力降低；太高反应特异性降低。●dNTP：100μM～200μM●模板DNA：50-200ng，高纯度，增加反应特异性●PCR用引物：根据目的基因两侧特定序列设计。约20bp左右；Ｇ＋Ｃ含量在40-70％之间；内部不能有回文序列；３’端不能互补。●PCR用DNA聚合酶：嗜热杆菌、耐热95℃●PCR用Buffer：Mg2+是辅基（2.0mM）。浓度太低酶活力降低；太高反应特异性降低。●dNTP：100μM～200μM反应Buffer•pH值,盐离子浓度•稳定剂,增强剂Mg2＋浓度•过高非特异性严重•过低无扩增产物dNTPMixture•浓度适当•避免反复冻融*反应体系对PCR扩增的影响#反应分为三步：DNA模板变性(denaturing)在93-95℃之间使模板充分变性单链DNA模板与引物退火(annealling)55℃左右，此温度选择根据模板和引物配对结合强弱而定，是反应特异性的决定因素引物延伸(extension)70-72℃左右，为Taq酶最适反应温度。#PCR原理：*30次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesof122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon8cycle=256Amplicon#PCR实验方法1.向无菌的200或500μlEppendorf管中依次加入以下溶液反应物体积10×buffer2.5μldNTP(1mM)2.5μlMgCl2(25mM)2.5μl引物2μl模板ＤＮＡ(20ng)4μlTaq酶(1U/ul)1μl无菌水10.5μl总体积25μl2.反应体系混匀，离心3.在PCR仪上设定以下程序：4.取20μl反应液加4μlLoadingbuffer在1.2％琼脂糖凝胶上90-120V，电泳30-50min。5.在凝胶自动成像系统上观察记录实验结果94℃预变性3-5min94℃变性30s55℃退火30s30个循环72℃延伸1min72℃延伸10min#PCR的种类逆转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）反向PCR（inversePCR）嵌套式PCR（nestingPCR）原位PCR（insituPCR）荧光定量PCR（fluorescentquantitativePCR）多重PCR（multiplexPCR）实时PCR（Real-timePCR）多重等位基因PCR（multiplexallelePCR）不对称PCR（asymmertricPCR）锚定PCR（anchoredPCR）长片段PCR（longfragmentPCR）逆转录酶DNA聚合酶mRNAcDNA杂化双链...