第五章PCR技术原理定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerasechainreaction)，是通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。PCR技术:PCR概念的提出1983，KaryMullis引物引物MullisMullis的的构思构思DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶特定特定DNADNA片段片段Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。不耐高温。Heat-stablepolymeraseisvitaltotheeaseoftheprocess…thermusaquaticusTaqDNA多聚酶的发现1988年Saiki等从温泉（Hotspring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。酶命名为TaqDNA多聚酶(TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。在1989年，Science将PCR中的TaqDNA多聚酶命名为当年的风云分子(Moleculeoftheyear)11、、PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理在微量离心管中在微量离心管中,,加入适量的加入适量的缓冲液缓冲液,,微量的微量的模板模板DNADNA,,四种脱四种脱氧单核苷酸氧单核苷酸,,耐热性耐热性多聚酶多聚酶,,一对合成一对合成DNADNA的的引物引物,,通过通过高温高温变性、低温退火变性、低温退火和和中温延伸中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程三个阶段为一个循环的反应过程,,每每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,,一般样品是经过一般样品是经过3030次循环次循环,,最终最终使基因放大了数百万倍使基因放大了数百万倍;;扩增了特异区段的扩增了特异区段的DNADNA带。带。一、一、PCRPCR技术的基本原理和工作方式技术的基本原理和工作方式①9494℃变性变性②50-65℃50-65℃退火退火③72℃延伸延伸2.PCR反应过程：20-4020-40个个PCRPCR循环循环1个PCR循环PCRPCR扩增原扩增原理理引物引物延伸延伸延伸延伸5’5’5’5’3’3’3’3’变性、退火变性、退火变性、退火变性、退火①模板：单链或双链DNA②引物：16-30bp合成的寡核苷酸③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶④底物：四种脱氧三磷酸核苷（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)⑤Mg2+Mg2+：：DNADNA聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂3.PCR基本要素4.PCR反应程序⑴94~96℃30’’-3’预变性（使模板DNA充分变性）⑵94℃30’’变性⑶50-60℃30’’-1’复性（使引物与模板充分退火）⑷72℃n’(按1’扩增1kb计算）延伸⑹72℃3-7’总的延伸（使产物延伸完整）⑺4-10℃保存⑸25-35个循环1）复性和延伸温度复性的温度是PCR扩增是否顺利的关键因素，通常在50-60℃之间。具体的温度主要由引物的Tm值决定（低于Tm值2-3℃）。延伸温度绝大多数设定为72℃。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法PCR。2）反应时间变性一般使用30秒钟，如果模板的G+C含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有30秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用1kb用1分钟来保证充足的时间。3）循环次数循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为25～35次。平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP和DNA聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。4）PCR反应液的配制最后加入DNA聚合酶。早期的PCR仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。热启动（hotstart）PCR操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。总体积总体积50-10050-100ll①①缓冲液缓冲液②②dNTPdNTP（底物）（底物）③③引物引物④④模板模板⑤⑤DNADNA聚合酶聚合酶55、反应体系、反应体系①①缓冲液：提供合适的缓冲液：提供合适的PHPH值和值和DNADNA聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂10mMTris·HCl10mMTris·HCl（（pH8.3-9.0pH8.3-9.0），），1.5mM1.5mMMgCl2，50mMK+...
