荧光定量PCR技术在临床检测中的应用黄少军市中心医院PCR与基因诊断技术•基因诊断即通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。•Polymerasechainreaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种DNA的快速扩增技术。PCR技术通过两个短的称为引物的DNA小片段和一种耐热酶的作用，可在3个小时内把特定的DNA片段扩增1000万倍。•九十年代中期PCR临床应用在国内全面开展，1998年，荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测。4基因诊断3免疫学诊断临床诊断细胞膜细胞核DNA转录mRNA翻译蛋白质1形态学诊断2生化诊断概念基本原理•以DNA为例•（1）DNA变性：•（2）降温退火：•（3）引物延伸：原理第一步–加热变性•预处理第二步–引物与靶序列退火第三步-引物延伸第1个PCR循环完成后–得到两个拷贝的靶序列PCRPCR.exe动画30次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,824荧光PCR的原理PCR技术的特点灵敏度高特异性强快速简便应用范围广Ct值的意义Ct值与重复性同一样本在相同条件下同时进行96次扩增FQ-PCRCt值与浓度不同的模板达到荧光域值时的Ct值不同感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断母婴传播的控制与观察母婴传播的控制与观察遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断肿瘤的诊断肿瘤的诊断法医学鉴定法医学鉴定荧光定量PCR的临床应用早期诊断早期诊断病情评估和预后判断病情评估和预后判断抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导新药验证新药验证一感染性疾病1.病原体含量与病情之间的关系2.病原体含量与用药之间的关系3.药物及疗法的研究与开发4.新的病原体分子诊断标准5.新的愈后指标6.传染病发病的监控、预测与预防临床应用临床应用二肿瘤1.肿瘤标志物：癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等2.肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因三遗传病1.等位基因检测2.多基因遗传病的突变检测3.基因表达异常所致遗传病检测1.亲子鉴定2.法医物证3.PCR-RFLP技术的法医学应用4.罪犯鉴定法医鉴定法医鉴定•免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在较长的“窗口期”，不利于对疾病的早期诊断；PCR方法直接检测病原体的DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏度的检测显然也有利于疾病的早期诊断。疾病的早期诊断疾病的早期诊断荧光定量PCR在病原体检测中的应用一肝炎病毒定量检测二性病病原体检测三结核杆菌及呼吸道病原体检测四优生优育(TORCH)相关项目检测临床应用壹肝炎病毒定量检测贰HBV叁HCV临床应用（一）乙型肝炎病毒结构及特点HBsAg：是HBV感染的主要标志HBsAb：保护性抗体HBcAg：仅存于感染的肝细胞核内，一般不存在于血循环中HBcAb:非保护性抗体，HBcAb-IgM提示HBV处于复制状态HBeAg：HBV复制及强感染性的指标HBeAb：有一定的保护作用，预后良好HBVHBV（二）HBV-DNA与“两对半”1.“1.“两对半”：机体的免疫反应状态；两对半”：机体的免疫反应状态；2.“2.“携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能反应体内病毒复制水平与感染程度。反应体内病毒复制水平与感染程度。FQ-PCRFQ-PCR：检测的是：检测的是HBVHBV本身的遗传物质—本身的遗传物质—DNADNA，是，是病毒存在和复制的最可靠、最直接病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。的指标。3.血清学指标(－)不能排除HBV感染。HBV（二）HBV-DNA与“两对半”HBsAg(－)HBV-DNA(＋)HBeAg(－)HBV-DNA(＋)4.4.也可能出现也可能出现HBsAg(HBsAg(＋＋))，，HBV-DNA(HBV-DNA(－－))。。5.HBsAb(5.HBsAb(＋＋))、、HBcAb(HBcAb(＋＋))、、HBeAb(HBeAb(＋＋))三抗三抗体阳性体阳性与与HBVDNA2.5×HBVDNA2.5×103copy/ml/ml结果解释。结果解释。HBV(三)HBV-DNA定量检测的临床意义3.HBV-DNA定量与预后a.含量高者急性肝炎患者易慢性化b.癌变的几率明显高于含量低者1.HBV-DNA定量与HBV复制水平及传染性2.HBV-DNA定量与乙肝药物疗效a.专家提出<103copy/ml做为阴性或临...
