PCR引物设计及逆转录PCR解析VIP免费

•PCRPCR（（PolymeraseChainPolymeraseChainReaction)Reaction)技术即技术即聚合酶链式反应聚合酶链式反应，又，又称称DNADNA体外扩增技术。体外扩增技术。•19851985年由美国年由美国PE-CetusPE-Cetus公司的公司的MullisMullis等人发明，荣获等人发明，荣获19931993年度诺贝年度诺贝尔化学奖尔化学奖。。①①DNADNA半保留复制半保留复制的机理；的机理；②②体外体外DNADNA分子于不同温度下可分子于不同温度下可变变性和复性性和复性的性质。的性质。PCRPCR的基本原理的基本原理PCRPCR扩增体系扩增体系模板（Template）：基因组、质粒DNA、cDNA，也可以使细菌、组织样品等。引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性；确定扩增产物长度。DNA聚合酶（DNAPolymerase）：推动PCR反应进行的机器。扩增效率和保真性。缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和离子强度，为DNA聚合酶提供最佳工作环境。脱氧核苷酸（dNTP）：DNA的基本组成元件，包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP。Mg2+、K+、增强剂1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（95℃，30s）。2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（45～65℃，30s）。3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（72℃，30～60s）。PCRPCR的基本原理的基本原理高温变性高温变性低温退火低温退火中温延伸中温延伸•理论：2n递增（n为循环次数），如果扩增30循环，目标DNA可增加230也就是109倍。•实际：由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106～107。PCRPCR扩增曲线扩增曲线1.早期（E期）:引物在单链DNA模板上搜索互补序列，并与特定位点杂交。2.中期（M期）：扩增反应顺利进行，产物呈指数型增长。3.晚期（L期）：平台期，DNA聚合酶过度损耗或者产物的抑制。PCRPCR扩增条件扩增条件循环PCR反应条件94℃5min94℃30s56.2℃30s72℃30s72℃7min4℃∞PC1-P20：模板：基因组DNA；产物：506bp举个例子PCR体系（10μL）模板：1μL上游引物：0.2μL下游引物：0.2μLEasyTaq酶：0.1μLEasyTaqBuffer：1μLdNTP：0.8μLddH2O：6.7μL30个循环1.避免PCR试剂的污染2.最适合的反应条件3.设置对照组：①PCR空白对照：在反应体系中剔除反应模板。②PCR阴性对照：即反应体系中用无关的基因片段代替目的模板。③PCR阳性对照：即反应体系中以已知能够成功进行特异性扩增的模板。PCRPCR的注意事项的注意事项1.为什么完全没有PCR扩增产物？①试剂质量问题或者加样时出错，导致反应体系不完整。②聚合酶失活或反应体系中有聚合酶抑制剂。③PCR仪温度控制不精确。④模板DNA发生降解。⑤引物或反应温度设计不合理⑥靶片段GC含量过高或扩增对象长多常见问题2.为什么出现多条非特异性条带？①反应体系被污染。②引物特异性差。③退火温度不合适。常见问题3.为什么PCR产物很少？①聚合酶活性过低。②循环次数偏低。③模板DNA浓度过低。常见问题4.为什么PCR产物出现片状拖尾？①DNA聚合酶过多或酶活性差。②dNTP和Mg2+浓度过高。③退火温度过低，PCR循环数偏多。④模板DNA用量过大或模板DNA不纯。⑤引物特异性差、引物间形成二聚体导致非特意扩增。常见问题普通PCR仪温度梯度PCR仪实时荧光定量PCR仪为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物是PCR特异性反应的关键，同时也与PCR扩增的效率密切相关。引物设计的最重要的原则：最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物设计的目的1、引物应具有足够的特异性。如果需要从基因组等较复杂的模板中扩增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列的非特异性。引物与非特异序列的同源性不超过70%或有连续8个互补碱基。NCBIPrimerBLAST引物设计的基本原则2、避开易形成二级结构的模板序列区域。分子内互补、发夹结构、分子间互补。二级结构会这家引物与模板杂交以及PCR的困难，因此要尽可能避开这种序列区域。用有关软件预测mRNA的稳定二级结构。引物设计的基本原则3、引物长度一般为18-30个碱基之间。引物长度与反应的特...