考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量

实验一 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量 【实验目的】 1．掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和过程。 2．熟悉蛋白质含量测定的影响因素。 【实验原理】 1976 年Bradford 等建立了用考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合，迅速、灵敏的定量测定蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从 465 nm 变为 595 nm，光吸收增加。蛋白质-染料复合物具有较大的吸光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为 1 g 蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需 2 分钟，结合物的颜色在 1 小时内是稳定的。由于该法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。 NCH2CH3CH2N+CH3CH2CH2NHCH3CH3OCH2CH3SO3-SO3Na蛋白质+ 蛋白质-染料复合物H+考马斯亮蓝G-250（蓝色，λmax 595nm） 【仪器与试剂】 1．紫外-可见分光光度计，微量注射器。 2．考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，85%(W/V)磷酸。 【实验步骤】 1 ．标准蛋白质溶液的配制 称取牛血清白蛋白适量，加水溶解并配制成 1 mg/ml 的溶液。 2 ．蛋白试剂的配制 称取100 mg 考马斯亮蓝G-250，加入95%乙醇50 ml 溶解，再加入85%(W/V)磷酸100 ml，将溶液用水稀释至1000 ml。试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%(W/V)磷酸。 3 ．标准曲线的制作 取标准蛋白质溶液5、10、20、50、100 l 于小试管中，用水稀释至0.1 ml，然后分别加入5 ml 蛋白试剂，充分振荡混合，2 分钟后于 595 nm 测定其吸光度值。以 0.1 ml 水及 5 ml 蛋白试剂作为空白对照。以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。 4 ．样品测定 取含 10~100 g 蛋白质溶液于小试管中，加水稀释至0.1 ml，然后加入5 ml蛋白试剂，充分振荡混合，2 分钟后于 595 nm 测定其吸光度值。以 0.1 ml 水及 5 ml 蛋白试剂作为空白对照。根据吸光度值计算样品中蛋白质的含量。 【实验结果】 1．绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。 蛋白质重量（mg） 体积（l） 5 10 20 50 100 CS（mg/ml） A 回归方程和相关系数 2．计算蛋白质的含量。 W x（mg） A Cx（mg/ml） 蛋白质含量（%） RSD（%） 【注意事项】 1．牛血清白蛋白预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度确定称取量，或根据牛血清白蛋白的紫外吸光系数为6.6 来确定。 2．一些阳离子，如...