蛋白质与酶工程酶的提取分离和纯化一、概述二、酶的提取三、酶的分离纯化四、酶的结晶五、浓缩与干燥六、酶纯化步骤的设计及评价酶的提取、分离和纯化一、概述1-1酶提取与分离纯化的定义将酶从细胞或其它含酶原料中提取出来，再与其它物质分开，从而获得所需酶的技术过程*酶的纯化程度根据需要而定*纯化方法多种多样，为获得较好的效果往往是2种或2种以上联合应用1-2提取纯化之目的1)酶催化功能的应用2)酶学研究酶的结构、功能、催化机制、催化动力学酶的生物合成及其调控规律等1-3纯化的必要性1)生物细胞中同时存在多种多样的酶2)多酶可能作用于同一个底物3)酶在生物细胞中的分布并不是均一的二、酶的提取（extraction)2-1了解所分离酶在细胞中的分布1、细胞外酶：由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶；大多属于水解酶，通常含量高，容易得到2、细胞内酶：在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用。该类酶在细胞内往往与细胞器结合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序性真核细胞内酶的分布①细胞膜：ATP酶、腺苷酸环化酶等②细胞核：DNA聚合酶、连接酶和RNA聚合酶等③线粒体：三羧酸循环、电子传递、氧化磷酸化、尿素循环、脂肪酸氧化、脂肪酸合成酶以及蛋白质合成、DNA聚合酶、RNA聚合酶等④高尔基体：多糖、核蛋白粘液生成酶⑤溶酶体：各种水解酶等⑥叶绿体：参与光合作用形成ATP、NADPH有关的酶类、与暗反应有关的酶系线粒体主要酶的分布（约有120种酶）部位酶的名称外膜单胺氧化酶、犬尿氨酸羟化酶、NADH-细胞色素C还原酶、脂类代谢有关的酶（酰基辅酶A合成酶、脂肪酸激酶等）特征酶：单胺氧化酶膜间隙腺苷酸激酶、核苷酸激酶、二磷酸激酶、亚硫酸氧化酶特征酶：腺苷酸激酶内膜细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶、NADH脱氢酶、肉碱酰基转移酶、-羟丁酸和-羟丙酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、ATP合成酶系、腺嘌呤核苷酸载体特征酶：细胞色素（c）氧化酶基质柠檬酸合成酶、乌头酸酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、延胡索酸酶、谷氨酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶复合体、天冬氨酸氨基转移酶、蛋白质和核酸合成酶系、脂肪酸氧化酶系特征酶：苹果酸脱氢酶2-2起始材料的选择原则：选取酶含量高的材料可以是天然的动植物或人工培养的微生物、动植物细胞等*注意材料的生长阶段*注意酶在生物体内的富集区域由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料和成本的限制，因此，目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂2-3细胞膜和细胞壁的破碎1、主要方法：1）2）超声波破碎法3）4）2、选择原则如酶法+超声2-4酶的提取1、定义在适当条件下，用适当的提取液处理含酶原料，使酶充分溶于其中的过程。2、提取液的选择根据酶的结构和溶解特性来选择适当的提取液*极性物质易溶解于极性溶剂，反之，即相似相溶*酸性物质易溶解于碱性溶液，反之亦然。2-4酶的提取3、常用的提取液：酶通常都溶于水，因此通常用水作为溶剂，配制成一定浓度的稀酸、稀碱、稀盐溶液进行抽提4、有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂抽提，如：丙酮粉，有助于酶与脂肪或磷脂膜分离；高离子强度水溶液也有助于酶从结合的膜上解析下来。2-5主要的提取方法1、盐溶液提取该法用于在低浓度盐溶液中溶解度大的酶的提取常用的盐浓度：0.02-0.05mol/L，大多数P酶用该法提取R酶常用0.14mol/L的NaCl溶液提取。*盐溶现象：低盐条件下，酶在水中的溶解度随盐浓度升高而增加的现象*盐析现象：当盐浓度达到一定界限后，酶的溶解度则随盐浓度升高而降低的现象2、酸溶液提取在酸性条件下溶解度大并稳定的酶可用此法如：胰蛋白酶（pI=8.9）可用0.12mol/L的硫酸溶液3、碱溶液提取在碱性条件下溶解度大并稳定的酶该法适用如：大肠埃希菌的L-天冬酰胺酶（pI=4.85）可用pH11-12.5的溶液4、有机溶剂提取：如酶与脂质结合牢固，或含有较多非极性基团的酶，可用与水混溶的有机溶剂（乙醇、丙酮、丁醇等），如：P酶：胆碱酯酶、细胞色素氧化酶、琥珀酸脱氢酶等用丁醇萃取，有较好效果R酶：可用酸苯酚溶液提取主要的提取方法小结地5、影响酶提取的其它重要因素温度：适当提高，可以提...
