吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色 AO / EB 原理与流程 zhongyisheng: 1 原理：吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核 DNA，使之发出明亮的绿色荧光。溴乙锭(E 仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核 DNA，发橘红色荧光。凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异，很易判别。在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞(NVN)，核染色质着橘红色并呈正常结构；晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。 2 AO/EB 染色及观察结果：取 20-100μ l 的 1：100 稀释的染色剂置于载玻片的贴壁细胞上室温下静置 20min，PBS 洗涤 2-3 遍，上覆盖玻片，荧光显微镜下观察结果并计数 20-200 个细胞。 ym1051: 1.能否提供具体实验步骤? 2.您在文中所说的"1：100 稀释的染色剂"是怎样稀释的?如何在载玻片上种上贴壁细胞? zhongyisheng: 1 用1mlEP 管稀释时，先取微量的染色剂，然后再取稀释剂（如BSA）加入 EP 管吹打即可。 2 消毒灭菌处理后的盖玻片平放入培养皿或中即可实验。 ym1051:我好像已明白具体过程了:首先要进行细胞爬片,然后将染色剂滴加在已爬有细胞的盖玻片上,温育后洗涤,再盖上盖玻片则可进行观察了.是这样吗?如果不经过爬片处理而将细胞进行消化,再将细胞和染色剂滴加在盖玻片上进行观察,行吗? zhongyisheng: 的确，不经过爬片而是将贴壁细胞消化下来一样可以进行进一步的实验。这是悬浮细胞的典型方法。当然，由于进行免疫组化染色进行的形态学检查经常考虑到细胞的原貌，在国际上比较通用，尤其是在进行动态检查时。 医琳师妹：我将我所作的方法与大家共享： 吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色测定PC12 细胞凋亡（acridine orange/ethidium bromide, AO/EB）： 1）细胞爬片：在 6 孔培养板中预先置入玻璃盖玻片，接种细胞悬液，干预后，予95%乙醇固定15 分钟，微干，然后准备荧光染色。将100mg/L 溶于 PBS 的吖啶橙和100mg/L 溶于 PBS 的溴化乙锭各5μ l（临用前混合加入，加样量宜小，有时各2μ l-5μ l 足够，量太大容易形成细胞凋亡的假阳性），在照相前混匀后加入，轻轻吹打，30 秒后用激光共聚焦显微镜观察照相。（有人用15mg 吖啶橙溶于100ml pH6.8 的 PB...
