第八章酶分子的定向进化广州大学生命科学学院柯德森第一节酶分子定向进化简介一.概念:分子定向进化：在实验室试管中模拟达尔文的自然进化原理，对蛋白质(酶)的基因利用随机突变和随机杂交的方法加以改造，通过大规模筛选，从而得到性能上改良的优异变种。使蛋白质(酶)在自然界需要几百万年才能完成的进化过程缩短至几个月，为蛋白质(酶)的工程应用提供了一个强有力的技术手段。属于蛋白质的非合理设计,它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制,人为地创造特殊的进化条件,模拟自然进化机制(随机突变,基因重组和自然选择),在体外改造酶,并定向选择(筛选)出所需要性质的突变酶.可以促使群体生物大分子向任意功能目标进化，从而获得或改良功能大分子。可以在几星期或几个月增强基因或蛋白质的某种特性，将可用于制造副作用更小的新药物、营养价值高的作物品种，或更有益于环境的化学加工等等。一.基本原理:合理设计与非合理设计:在比较充分了解酶的结构和功能的基础上对酶分子进行改造,称为合理设计;不需要准确的酶分子结构信息,通过随机突变,基因重组,定向筛选等方法对其进行改造,称为酶分子的非合理设计.非合理设计实用性较强,往往可以通过随机产生的突变改进酶的特性.其基本技术手段:易错PCR,DNA重组,高突变菌株等技术.达尔文进化所有自然界存在的酶均是基于自然选择的达尔文进化的产物。受自然界中成就的启发，科学家们开始掌握和应用这一进化理论，在实验室中完成达尔文进化，这不仅包括生物机体与细胞水平，还包括在单个的生物大分子水平上。达尔文进化主要包括重复进行的三个过程：选择、扩增和变异选择，不管是自然的或人工的，均是一个从“不富有者(thehave-nots)”群体中分离“富有者(thehavesorthefecund)”的扬弃过程。在实验室中，富有者则是那些能满足实验人员所附标准要求的分子。扩增，就是产生子代；更确切地说，就是备份遗传基因。在实验室中，实验人员将选择与扩增关联，仅使那些能满足所附标准要求者产生子代。确切地说，不是所选分子本身，而是它们的基因被扩增。变异，就是引入变种。定向分子进化的功效在于巨大数量的力量和分子多样性。二、天然酶分子虽然已经进化了千百万年,但仍然蕴藏着具大的发展空间:①天然酶在生物体内存在环境与酶的实际应用环境不同.因此提供了在实际环境中的巨大的进化空间;②自然的选择压力是酶分子与各种生物分子之间协调作用,以适应周围环境的需要,而实际应用中总是希望该酶活力和稳定性越高越好.自然的选择压力更多地是体现在更好地调节能力,而不是活性和稳定性的提高;当人为创造需要高活力和高稳定性的选择压力时,就可能使酶向相应的目标进化;第二节定向进化的策略易错PCR:使用Taq酶进行PCR扩增目的基因时,通过调整反应条件,例如提高Mg2+浓度,加入Mn2+,改变体系中四种dNTP的浓度等,改变Taq酶的突变频率,从而向目的基因中,以一定的频率随机引入突变构建突变库然后选择或筛选需要的突变体.连续易错PCR:即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板,连续反复地进行随机诱变,使每一次获得的小突变积累而产生重要的有益的突变.第二节定向进化的策略DNA改组技术:是一种有性PCR,将已经获得的存在于不同基因中的正突变结合在一起组成新的突变基因库.其基本的操作过程是从正突变基因库中分离出来的DNA片段用脱氧核糖核酸酶I随机切割,得到的随机片段经过不加引物的多次PCR循环,随机引物片段之间互为模板和引物,直到获得全长的基因,这导致来自不同基因片段之间的重组.该策略将来自亲本基因中的优势突变尽可能地组合在一起,在理论上优于连续的易错PCR等无性进化的策略.定向进化的选择策略:①筛选的方法必须灵敏,至少与目的性质相关;②筛选的方法必须有明显的可供测量的信号;③选择的标准必须是合乎研究目的的指标突变体的构建及应用(一)构建理想基因文库要考虑的因素:1.基因文库的质量:文库的代表性和突变基因片段的完整性文库的代表性:指文库包含的DNA分子是否能完整地反映出来源基因的全部可能的变化和改变,是体现文库质量的最重要指标;突变基因的完整性:突变DNA片段应尽可能地完整反...
