ELISA实验设计

PRRSV N 蛋白抗体检测间接ELISA 方法的建立 1 材料： 1.1 蛋白、血清、酶标二抗 原核表达PRRSV N蛋白； 标准阳性血清和阴性血清，待检血清； 自制HRP标记兔抗猪IgG； 1.2 主要试剂和溶液 包被液（50 mmol/L pH9.6 的碳酸盐缓冲液） Na2CO3 1.59 g NaHCO3 2.93 g 准确称取后，溶于950 mL 的蒸馏水中，调pH 值为9.6，定容到1 L； PBS-T 洗涤液 1000 mL 10 mmol/L pH7.4 的PBS 中加入0.5 mL Tw een-20； 封闭液和血清稀释液 含10%小牛血清的PBS-T 缓冲液，10%马血清的PBS-T 缓冲液，含5%BSA 的PBS-T 缓冲液，含10%BSA 的PBS-T 缓冲液，含5%脱脂奶的PBS-T 缓冲液； 底物溶液 100 mmol/L 的柠檬酸溶液（21 g 柠檬酸C6H6O7•H2O 溶于去离子水，定容至1 L）24.3 mL，200 mmol/L Na2HPO4•12H2O（71.6 g Na2HPO4•12H2O 溶于去离子水，定容至1 L）25.7 mL 混匀，加入50 mg 的四甲基联苯胺（TMB），临用前加入50 μL 的30% H2O2； 终止液（2 mol/L H2SO4） 每200 mL 终止液，由蒸馏水177.8 mL 和浓硫酸22.2 mL混和而成。 1.3 主要仪器设备 电热恒温培养箱；4℃冰箱；酶标仪。 2 步骤： 2.1 抗原包被浓度和二抗稀释度的确定 将原核表达的N 蛋白分别作 2.0 μg/mL，1.0 μg/mL，0.5 μg/mL，0.25 μg/mL，0.1μg/mL，0.05 μg/mL 连续稀释6 个稀释度，每个稀释度重复两孔，100 μL/孔，4℃包被酶标反应板过夜。将自制HRP 标记的兔抗猪二抗分别做 1:50、1:100、1:200 和1:400 一系列倍比稀释，每个稀释度重复两孔，100 μL/孔，组成方阵确定重组蛋白的最佳包被浓度和二抗稀释度。封闭1 h 后，每个稀释度重复两孔，100 μL/孔，各步 37℃反应 30 min，显色 5min 后终止。在酶标仪测定各孔OD450nm值。先取阳性OD450nm值在1 左右的，然后再从中找出阳性血清OD450nm 值和阴性血清OD450nm值之比（即P/N）最高的反应孔的抗原浓度和二抗稀释度为最佳抗原包被浓度和二抗稀释度。 表1 N 蛋白最佳抗原包被浓度和酶标二抗稀释度确立 2.0 μg/mL 1.0 μg/mL 0.5 μg/mL 0.25 μg/mL 0.1 μg/mL 0.05 μg/mL 1:50 P* N P/N 1:100 P N P/N 1:200 P N P/N 1:400 P N P/N 2.2 缺失肽包被条件的确定 以最佳抗原浓度包被酶标板。以37℃包被2 h 加 4℃过夜；4℃过夜和37℃包被2 h 四种条件包被酶标板，其余条件不变进...