竹密岂妨流水过蛮鬼 2018.3山高哪碍野云飞稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存 2-3 年，质粒-20℃保存 2-3 年，病毒液-80℃保存 1 年）（1）载体质粒：两端的 LTR、剪切位点、包装信号 Ψ 以及抗性或荧光基因、gag 基因 5′端 350bp 的序列及位于 env 序列中的 RRE，含宿主 RNA 聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了 pol、gag 包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了 env 基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。2、包装细胞：293T 细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后 4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl 溶液（聚乙二醇）：NaCl8.766 g; PEG8000 50g 溶解在 200ml Milli-Q 纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存 3 天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene 能提高感染效率 2～10倍。有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后 3 代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105 个 293T 细胞，加入全培养基双抗 DMEM 4-5ml，过夜2、配制 5X PEG8000/NaCl 溶液称取 NaCl 8.766 g; PEG8000 50g 溶解在 200ml Milli-Q 纯水中；121 摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在 4℃第二天1、配管A 管试剂PLKO.1/pCDHpsPAX2pMD2.GOptiB 管XTREME-GENEOpti加样量/μl推荐量/μl、μg合计3122006200206206A+B 混合室温静置 20min2、加入 2ml 全培养基 DMEM3、将 1 加入 2，孵育 10h，换成 5ml 全培养基1/5（稳转）竹密岂妨流水过蛮鬼 2018.3山高哪碍野云飞第四天第五天：1、9:00 和 17:00 各收取一次 5ml 培养液，共 20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为 0.45mm 的过滤器除去上清中的 293T 细胞3、加入 5ml 5XPEG8000/NaCl 溶液，每 30min-1h 上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、...
