单克隆抗体制备实验过程 一、 免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏 B 淋巴细胞的过程。 一般选用 6-8 周龄雌性 Balb/c 小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应 B 淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏 B淋巴细胞。 说明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。 PS：1、一般皮下注射每个注射点注射 30-50ul 左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射 6-8 个点为宜。 2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。 3、冲击免疫完成后，应在96 小时内完成细胞融合，否则相应的B 细胞数量会下降到未冲击前的水平。 二、细胞融合 （Cell fu sion） 【材料和试剂】 （1）骨髓瘤细胞悬液 选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。 （2）免疫小鼠脾细胞悬液 取 3 天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，•分离血清冻存备用。拉颈处 死 小鼠，浸 泡 于 75％ 酒 精 中3～ 5min。无 菌 操 作 取出脾脏，置 入 盛 有 5ml 不完全培养液的平皿 中洗 涤 ，剪 去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml 不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3～5 个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml 离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min离心5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml 不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5～2×108 个脾细胞。 （3）饲养细胞 将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml 不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部 1 分钟，随后吸出注入的培养液。1000r/min 离心5-10 分钟，弃上清。先用5ml HAT 培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT 培养基，使细胞浓度为2×105/ml，备用。 （4）主要试剂的配制 ①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640 或DMEM（Dulber...
