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原代细胞培养和传代培养的方法及其

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初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器:培养箱(调整至37℃),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃) 材料:动物组织块 试剂:1640 培养基(含 20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank′s液,碘酒 初代消化培养法 1. 准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒 20 分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局:点燃酒精灯,安装吸管帽。 3. 处理组织:把组织块置于烧杯中,用Hanks 液漂洗 2~ 3 次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中30~ 60 分钟。 4. 剪切:用眼科剪把组织切成2~ 3 毫米大小的块,以便于消化。加入比组织块总量多 30~ 50 倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化:或用恒温水浴,或置于 37℃温箱消化均可,消化中每隔 20 分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离:在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块。低速(500~ 1000 转/分)离心消化液 5 分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液。 7. 计数:用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中。对大多数细胞来说,pH 要求在 7.2~ 7.4 范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说明液体变酸,可用NaHCO3调整。 8. 培养:置于 36.5℃温箱培养,如用CO2 温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切:把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中,用Hanks 液漂洗二三次以去掉表面血污,吸静Hanks 液,用眼科剪反复剪切 1mm3 块为止。 2. 摆布:用弯头吸管吸取若干小块,置于培养瓶中,用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部,小块相互距离以0.5cm 为宜,每一25ml 培养瓶底可摆布 20~ 30 块。 3. 轻轻翻转培养瓶,另瓶底向上,注意翻瓶时勿另组织小块流动,塞好瓶塞,置36.5℃温箱培养2 小时...

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