精品文档---下载后可任意编辑HPV16 型 E6 基因沉默细胞克隆的建立及深化讨论的开题报告一、讨论背景和意义：宫颈癌是一种流行于女性的恶性肿瘤，它的主要原因是人类乳头瘤病毒(HPV)感染，其中型别 16 是最常见的致癌病毒。在 HPV16 感染的过程中，E6 基因是一个具有重要生物学功能的病毒蛋白。病毒 E6 蛋白可以结合并分解宿主细胞的 p53 蛋白，使得宿主细胞失去抑制癌症发生的能力。因此，病毒感染的宿主细胞往往表现出失控生长的现象，最终导致宫颈癌的发生。目前讨论表明，沉默 HPV16 E6 基因的宿主细胞可以对病毒的致癌作用进行抑制，为讨论 HPV16 感染机制以及宫颈癌治疗提供了新的可能性。因此，本课题旨在通过建立HPV16 E6 基因沉默的细胞克隆，并对其生物学特性进行深化讨论，为进一步的宫颈癌治疗讨论提供基础实验支持。二、讨论内容：1.构建 HPV16 E6 基因沉默的表达载体，并在宫颈癌细胞系 SiHa 中进行转染。2.筛选出成功沉默 HPV16 E6 基因的细胞克隆。3.对比沉默和未沉默 HPV16 E6 基因细胞克隆的生长特性以及亚细胞结构特征。4.对比沉默和未沉默 HPV16 E6 基因细胞克隆对 DNA 损伤的反应。5.讨论沉默和未沉默 HPV16 E6 基因细胞克隆的凋亡特性。6.探究沉默和未沉默 HPV16 E6 基因细胞克隆活性氧的水平及其与癌症发生的关系。三、讨论方法：1.合成 shRNA 序列，构建 shRNA 表达载体。2.在宫颈癌细胞系 SiHa 中采纳脂质体介导的方法进行转染，用 Real-time PCR 和Western blot 检测细胞中病毒 E6 基因的表达水平。3.通过克隆盘稀释法选出单个克隆。4.采纳细胞增殖分析和 MTT 实验测定细胞的增殖能力。5.采纳光镜、电子镜等技术观察细胞的亚细胞结构。6.利用单细胞凝胶电泳技术(DNA comet assay)检测细胞对 DNA 损伤的反应。7.测定细胞的凋亡指标，包括 Annexin V-FITC/PI 双染法、Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling(TUNEL)法等。8.测定细胞中活性氧的水平。精品文档---下载后可任意编辑四、讨论预期结果：1.成功构建 HPV16 E6 基因沉默的细胞克隆。2.通过对比沉默和未沉默细胞克隆的生长曲线、亚细胞结构以及对 DNA 损伤的反应，讨论沉默 HPV16 E6 基因对细胞生物学特性的影响。3.讨论沉默和未沉默 HPV16 E6 基因细胞克隆的凋亡特性，探究 E6 基因在癌细胞生长中的作用机制。4.探究沉默和未沉默 HPV16 E6 基因细胞克隆活性氧的水平及其对 HPV16 感染机制的影响。
