实 时 荧 光 定 量 PCR 实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术 于 1996 年 由 美 国 Applied Biosy stems 公 司 推 出 ，由 于 该 技 术 不 仅 实 现 了 PCR 从 定 性 到 定 量 的 飞 跃 ， 而 且 与 常 规 PCR 相 比 ，它 具 有 特 异 性 更 强 、 有 效 解 决 PCR 污 染 问 题 、 自 动 化 程 度 高 等 特 点 ， 目 前已 得 到 广 泛 应 用 。 本 文 试 就 其 定 量 原 理 、 方 法 及 参 照 问 题 作 一 介 绍 。 一 . 实 时 荧 光 定 量 PCR 原 理 所 谓 实 时 荧 光 定 量 PCR 技 术 ， 是 指 在 PCR 反 应 体 系 中 加 入 荧 光 基团 ， 利 用 荧 光 信 号 积 累 实 时 监 测 整 个 PCR 进 程 ， 最 后 通 过 标 准 曲 线 对 未 知模 板 进 行 定 量 分 析 的 方 法 。 1. Ct 值 的 定 义 在 荧 光 定 量 PCR 技 术 中 ， 有 一 个 很 重 要 的 概念 —— Ct 值 。 C 代表 Cy cle， t 代表 threshold， Ct 值 的 含义 是 ：每个 反 应 管内的 荧 光 信 号 到 达设定 的 域值 时 所 经历的 循环数（如图 1 所 示）。 图 1. Ct 值 的 确定 2. 荧 光 域值 （threshold）的 设定 PCR 反应的前15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍，即：threshold = 10 ´ SDcy cle 6-15 3. Ct 值与 起 始 模 板 的关 系 研 究 表 明 ，每 个模 板 的Ct 值与 该 模 板 的起 始 拷 贝 数 的对 数 存 在 线性 关 系〔 1〕 ，起 始 拷 贝 数 越 多 ，Ct 值越 小 。 利 用 已 知 起 始 拷 贝 数 的标准品 可作出 标准曲 线 ，其 中 横 坐 标代 表 起 始 拷 贝 数 的对 数 ，纵 坐 标代 Ct 值（ 如 图 2所 示 ） 。 因 此 ，只 要 获 得 未 知 样 品 的Ct 值，即可 从 标准曲 线 上 计 算 出 该 样品 的起 始 拷 贝 数 。 图 2. 荧光定 量 标准曲 线 4. 荧光化 学 荧光定 量 PCR 所 使 用 的荧光化 学 可 分 为两 种 ：荧光探 针 和 荧光染 料〔 2〕 。现 将 其 原...
