实时定量 PCR 一、基本原理 所谓实时定量 PCR（real-time PCR）技术，是指在 PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时定量 PCR技术中，有一个很重要的概念，即：Ct值（C代表 Cycle，t代表 threshold），Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的 Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct值。因此，只要获得未知样品的 Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时定量 PCR中所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。（1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的 5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR产物形成完全同步。（2）SYBR荧光染料：在 PCR反应体系中，加入过量 SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地参入 DNA双链后，发射荧光信号，而不参入链中的 SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR产物的增加完全同步。 图 2-3-4 用于检测 MicroRNA 前体的实时定量 PCR 引物设计 （引自 Schmittgen TD, Jiang J, Liu Q, Yang L.A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors.Nucleic Acids Res.2004;32(4):e43.） 最初，实时定量 PCR被用于定量检测小 RNA前体的表达（图 2-3-4）。与杂交方法相比，PCR方法可以高度灵敏地检测出低丰度表达的靶分子，并适于高通量筛选。PCR扩增前的逆转录反应可以使用随机引物或基因特异的引物，简要过程如下：首先将纯化的小分子量 RNA与引物混合，经变性、复性过程使引物与模板配对；然后加入逆转录酶、底物、DTT、以及 RNA酶抑制剂的混合物逆转录生成cDNA；再以 cDNA为模板进行实时定量 PCR。PCR引物设计遵循以下几个原则：（1）上下游引物都定位于小 RNA前体的茎环结构上；（2）假...
