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实时定量PCR

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实时定量 PCR 一、基本原理 所谓实时定量 PCR(real-time PCR)技术,是指在 PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时定量 PCR技术中,有一个很重要的概念,即:Ct值(C代表 Cycle,t代表 threshold),Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明,每个模板的 Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表 Ct值。因此,只要获得未知样品的 Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时定量 PCR中所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。(1)TaqMan荧光探针:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的 5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条 DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与 PCR产物形成完全同步。(2)SYBR荧光染料:在 PCR反应体系中,加入过量 SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地参入 DNA双链后,发射荧光信号,而不参入链中的 SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与 PCR产物的增加完全同步。 图 2-3-4 用于检测 MicroRNA 前体的实时定量 PCR 引物设计 (引自 Schmittgen TD, Jiang J, Liu Q, Yang L.A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors.Nucleic Acids Res.2004;32(4):e43.) 最初,实时定量 PCR被用于定量检测小 RNA前体的表达(图 2-3-4)。与杂交方法相比,PCR方法可以高度灵敏地检测出低丰度表达的靶分子,并适于高通量筛选。PCR扩增前的逆转录反应可以使用随机引物或基因特异的引物,简要过程如下:首先将纯化的小分子量 RNA与引物混合,经变性、复性过程使引物与模板配对;然后加入逆转录酶、底物、DTT、以及 RNA酶抑制剂的混合物逆转录生成cDNA;再以 cDNA为模板进行实时定量 PCR。PCR引物设计遵循以下几个原则:(1)上下游引物都定位于小 RNA前体的茎环结构上;(2)假...

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