利用实时定量-PCR技术通过2--△△CT-方法分析相对基因表达差异VIP专享

利用实时定量 PCR 技术通过 2 -△△CT 方法分析相对基因表达差异Kenneth J。 Livak and Thomas D. Schmittgen Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy。 Washington State University， Washington 99164-6534 现在最常用的两种分析实时定量 PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数;相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。 2 - △△ CT 方法是实时定量 PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导,假设及其应用。另外,在本文中我们还介绍了两种 2 — △△ CT 衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。 关键词：反转录 PCR 定量 PCR 相对定量 实时 PCR Taqman 反转录 PCR （ RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（ 1 － 3 ）。实时 PCR 技术和 RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（ 4 , 5 ）.实时定量 PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数;相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。 绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（ 6 － 9 ），包括已发表的两篇讨论论文（ 10 ， 11 )。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然,我们说 X 基因在经过某种处理后表达量增加 2。5 倍比说该基因的表达从 1000 拷贝 / 细胞增加到 2500 拷贝 / 细胞更加直观。 用实时 PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特别的公式、假设以及对这些假设的验证。 2 - △△ CT 方法可用于定量 PCR 实验来计算基因表达的相对变化： 2 — △△ CT 公式的推导 , 以及实验设计，有效性评估在 Applied Biosystems User Bulletin No。2（P/N4303859) 中有介绍。用 2 - △△ CT 方法分析基因表达数据在文献中也有报道 （5， 6) .本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。另外,本文还介绍了 2 - △△ CT 两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中都可能被用到。 • 2 — △△ CT 方法 • 2 — ...