蛋白提取实验环节:1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞,每 106 细胞加 250 ul RIP Ａ（在使用前数分钟内加入蛋白酶克制剂),振荡。假如需要提高蛋白浓度，可以合适减少细胞总蛋白提取试剂体积。B、对于贴壁细胞：a、用 T Ｂ S 冲洗细胞２-３次。最后一次彻底吸干残留液。b、加入合适体积旳 RIPA(使用前数分内加入蛋白酶克制剂）于培育板、瓶内３-５分钟。期间反复晃动培育板、瓶,使试剂与细胞充足接触。c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到 1.5ml 离心管中。C、冰浴 3 ０ min,期间用移液器反复吹打,保证细胞完全裂解。D、1g 离心 5min，收集上清,即为总蛋白溶液。2、组织蛋白提取:A、组织块用冷 TBS 洗涤 2-３次，清除血污，剪成小块置于匀浆器。加入１ 0 倍组织体积本试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶克制剂）冰上彻底匀浆。假如需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。Ｂ、将匀浆液转移至 1.５ ml 离心管中，振荡。冰浴30min,期间用移液器反复吹打,保证细胞完全裂解。Ｃ、1g 离心 5min，收集上清,即为总蛋白溶液。注意事项1、组织尽量新奇,若不能及时提蛋白，组织标本应保存在－８０℃冰箱，并避开反复冻融。2、全程必须在冰上进行，避开蛋白降解。3、蛋白酶克制剂在水溶液中不稳定，需在 R Ｉ PA 使用前数分钟加入蛋白酶克制剂。4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器(２０ 0μl)反复吹打,或再加入适量裂解液以保证充足裂解。5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶仍旧有活性)可在－80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与－20℃保存，避开反复冻融。
