引物设计常见问题

引物设计常见问题与解答(二)17. 长链引物为什么出错的几率非常高？答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到 100%,产生碱基插入，缺失，置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。讨论人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如 PCR 扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证 100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶 PCR 扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。18. 假如测序发现突变，该如何处理？答：对您遇到的困惑，我们表示同情。遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。假如确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。根据我们经验，40 个碱基以下的引物，测 1-2 个克隆就可以了；40 个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，假如发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。19. 假如测序发现引物突变，是否有补偿？答：没有。我们可以免费重合一次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任。原因我们在前面已提到，化学合成效率不可能达到 100%.您选择了化学合成引物，合成过程中一些副产品所带来的后果就可能不可避开的遇到。20. 引物是经过 PAGE 纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？答：理论上分析型 PAGE 变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备 PAGE 电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，PAGE 纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您假如减少 OD 数，引物遇到的问题可能就会少一些。21. 为什么 OPC 或 PAGE 纯化的引物，再用 HPLC 鉴定纯度不高？答： 有些用户引物需要纯度特别高的引物，在使用前会将 HPLC 鉴定...