方法一：1.首先需要把细胞养在玻璃片上(悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过得玻璃片）2.然后在 4％PFA 里面室温下固定 30 分钟,P Ｂ S 洗两次,０、1% Ｔ X-１ 00 室温下作用 1－２分钟使细胞膜通透。3.接下来进行荧光标记，需要在一个大得容器(面积大，扁平状得,比如大得培育皿）里面，放一张用水打湿得滤纸,以保持湿度。4.剪一片合适大小得 parafilm,在上面滴上稀释在 1%BSA/Ｔ BS 中得一抗（稀释倍数依具体抗体而定)，每个玻璃片 30u ｌ足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下)，室温下孵育 30 分钟,然后在Ｐ BS 里洗三次。5.接下来二抗孵育步骤同上。6.最后，在载玻片加上 moun ｔ i ｎｇ med ｉ u ｍ(大约每个玻璃片加 10ul)，把玻璃片放上去(细胞面朝下),37 度 30 分钟,然后就可以在荧光显微镜下观察了。7.抗体很重要,不能有非特异性结合.您可以先做 W Ｂ检测一下您得抗体，瞧瞧有没有杂带.8.双标得话,可以把两个一抗一起加或者分别标记两次(可以都试一下瞧瞧那种方法合适）。假如一个抗体需要二抗,一个就是直接荧光标记得，可以把荧光标记得那个与另外一个得二抗一起加。方法二:1.选取一抗时要来源于两种不同得动物,我用得就是来源于ｒａｂ bit 与ｒａ t 得抗体，二抗则就是不同荧光信号标记 得，我用得就是ｄ onkey anti-rab ｂ it－FITC(绿)与 do ｎｋ e ｙ anti-rat—Tex-Ｒｅ d（红)。2.我得做法就是两种一抗同时孵育,然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要认真摸索,我感觉一抗 4 度孵育过 夜比较好,背景比较清楚。3.我得阳性对比用得就是阳性组织切片，阴性对比则分别就是家兔与大鼠得 I ｇ G,荧光标记物对比就是 PB Ｓ+荧光标记物。4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用得就是 10％得正常ｄ o ｎ key 血清。5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。方法三:1.片子得制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在 24we ｌ l/12well/９ 6well 中直接染色2.细胞爬片得制作:直接购买公司得已经处理过得细胞爬片，要就是自己制作得话，就用无菌得盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。4.其实小得 well 得话,可以直接拿来染色，没问题得。5.固定:用Ｐ BS 洗去培育液，用固定液（如甲醇与丙酮;4％多聚甲醛;酒精。。。)固定细胞。6.内源性过氧化物酶处理，3%过氧化氢处理细胞（选作，二抗连 HRP 得必做，其她得如做免...
