生物学大实验(二)实验名称:质粒扩增、提取与鉴定实验 实验目得 通过对智力扩增、提取与鉴定试验得实验原理介绍与实际操作,加深对分子生物学基本技术得理解与掌握。实验仪器设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等.实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌与真菌细胞中,通过对细菌、放线菌与真菌得培育来实现对质粒得扩增。经过处理得线状 dna 在外界环境恢复正常得时候不能够复性 而质粒 d ｎ a 可以复性,从而可以实现质粒ｄｎ a 与染色体 d ｎ a 得分离。限制性内切酶能特意地结合于一端被称为限制性酶识别系列得 dna 系列之内或其附近得特异位点上,并切割ｄ na。当对提取得质粒 dn ａ进行电泳时，同一质粒 dna 其超螺旋形式得泳动速度要比开环与线状分子得泳动速度快。实验步骤： 一质粒扩增(1)普通 lb 固体培育基制备:制备ｌ b 培育基，倒入灭菌瓶中高压灭菌,待完全冷却后,保存备用。(2)将大肠杆菌接种于 lb 培育基中,37℃振荡培育过夜(２ 00 转/分) 二 质粒 dna 得提取(碱法)１将菌液倒入 1、5ml 得微量离心管中, 120 ００ r ｐ m 离心一分 30 秒,弃去上清液,以得到较多得细菌沉淀；2 、 将微量离心管开口倒置在卫生纸上,使离心管底部得液体流尽。3 、 加入 10 ０ μl 用冰预冷得溶液ｉ，剧烈振荡,将沉淀彻底悬浮，然后室温放置 5 分钟．4 、加入 200μ ｌ现配得溶液 i ｉ,盖紧管口,轻轻快速颠倒离心管(不要振荡,以避开 dna 断裂),使混合物混匀,冰浴５～10 分钟。5 、 加入 150μl 预冷得溶液 iii，盖紧管口，温与颠倒混匀,使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液ｉｉ i 中，冰浴５分钟。6 、取上部水相,移入新得离心管,加入 2 倍体积预冷得无水乙醇(也可同时加入 1/10 倍体积得醋酸钠),震荡混匀,室温放置 10 分钟沉淀双链 dna，然后 4 ,120℃００ｒ p ｍ离心 10 ｍ in。7 、 弃去上清液,将离心管倒置于卫生纸上,使离心管底部得液体流尽后, 加入预冷得１ ml 70％乙醇。8、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上,使液体流尽，置 dna 干燥 5～1 ０分钟。９、吸除上清液,将管口倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥 10 分钟或室温干燥.10 、将沉淀溶于３ 4υ ｌ te 缓冲液或灭菌水（ph8、0）中，储于-２ 0℃冰箱中三ｄ n ａ酶切反应1 、...
