ELLMAN 试剂法测定自由巯基和二硫键(12 页)Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。ELLMAN 试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm 没有吸收，与巯基反应后，生成 2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。TNB2-在 412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。 DTNB TNB2- 根据文献记载，TNB 的吸光系数在13.6*103M-cm-~14.25*103M-cm-之间[3,4]。吸光度测量的最灵敏范围在 0.2-0.7 之间。A=εbc，其中 A 为吸光度，ε 是摩尔吸收光系数或消光系数，ε 单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。以吸光度下限 0.2 来计算（吸光系数取 14.15*103M-cm-），需要 TNB 的浓度为 c=0.2/（14.15*103LM-cm-*1cm）=1.4*10-5mol/L (1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为 1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml.我们的条件可以达到这个检测限度。ELLMAN 试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：1. EDTA 的适量加入有助于 TNB 显色的稳定和成梯度线性关系[5]。2.在不同缓冲液中，TNB 的最大吸收波长略微不同，所以它们在 412nm 的吸收也不同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。另外，TNB的分光光度法分析对 SDS 很敏感[6]。3.DTNB 随着 pH 的升高，降解速度加快。在 pH7.0，其降解速度为 0.02%/h，在pH 值 8.0，其降解速度为 0.2%/h,随着 pH 值得升高，降解速度加快，在 pH 12 时，15min之内会完全降解[7,8]。4. 摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4]. 试验方案主要材料：1.材料PEG-G-CSF 批号：080229 浓度4.32mg/mlG-CSF 批号：080126 浓度6.9mg/ml10k 超滤膜 PALL2.试剂Sequencing Grade Modified Trypsin,Promega，lot#237826。20 ug/小瓶。加入 20 ul 50mM NH4HCO3，pH7.8 溶解，配成 1 ug/ ul的酶液。1M DTT 刘春凤提供TFA（三氟乙酸）：TEDIA Lot# 705114乙腈：Fisher Scientific Lot# 055848Starter kit for MALDI-TOF MS：BRUKER DALTONICS，Lot NO 2025-208241-001(including α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid(HCCA),peptide calibration standard,protein calibration standard I,protein calibration standard Ⅱ)PEG 肽段反相分离流动相 A 液：0.1%TFA/H2O B 液：0.1%TF...
