草莓高效再生体系的建立和抗除草剂Bar基因工程菌的构建

草莓高效再生体系的建立和抗除草剂 Bar 基因工程菌的构建本试验以适合安徽省栽培的草莓(Fragaria ananassa Duch)优良品种——丰香、鬼怒甘和章姬为试材,通过对茎尖增殖、叶片愈伤组织诱导、生根培育、移栽基质的筛选讨论,建立起草莓简单、快速、高效的茎尖离体再生体系,为草莓转基因讨论提供基础。再者,利用以LBA4404(pAL4404)、HB101(pRK2025)、DH5a(pBI121-bar)进行三亲杂交,为 bar基因转化提供工程菌。另外,对草莓 bar 基因转化农杆菌侵染体系作了初步探究。试验讨论获得的主要结果如下:1、草莓茎尖消毒不同处理的效果存在显著差异。其中,处理Ⅳ效果最好,成活率达到 90%,与其他处理的差异达到了极显著水平。2、在茎尖培育中,当外植体大小＞0.7mm 时,成活率高达 95.6%,外植体＜0.3mm 时成活率不到 20%;外植体大小为 0.3～0.5 mm、0.5～0.7 mm 时,成活率分别达到了 80%、84%。3、丰香、鬼怒甘及章姬的最佳增殖培育基分别为:MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.10mg/L、MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.10 mg/L、MS+BA 0.5 mg/L+NAA 0.20 mg/L。说明不同基因型的品种最佳增殖培育基存在差异。4、应用 SPSS 软件分析,得出诱导叶片愈伤组织的最佳培育基是:MS+BA 3.0mg/L+2,4-D 0.2 mg/L+IBA 0.3 mg/L。5、丰香、鬼怒甘、章姬生根的最适培育基分别为是:1/2MS+IBA 0.1 mg/L、1/2MS+IBA 0.0 mg/L、1/2MS+IBA 0.2 mg/L。6、分步炼苗后移栽,发酵过的稻壳+菜园土(1:1),成活率达到 98%左右;其它配方成活率也到达了 90%左右。7、利用三亲杂交法将真核表达载体 pBI121-bar 转入根癌农杆菌 LBA4404,通过菌落 PCR、质粒 PCR、质粒双酶切电泳检测,证明工程菌构建成功。8、试验筛选出浓度为 25 mg/L 和 20 mg/L 的卡那霉素分别是草莓试管苗、叶片愈伤组织分化阶段的适宜选择压。9、对工程菌抑制抗生素浓度筛选,Cef与 Carb 有效抑菌浓度均为 200 mg/L。