1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区 5’端得３ 00－400 ｂ p区域内，可以用 DN Ａ man，Alignm ｅ n ｔ 软件 瞧瞧结果。２、 产物不能形成二级结构(自由能小于 58、61K Ｊ/mol）。ﻫ3、引物长度一般在１7—２ 5 碱基之间,上下游引物不能相差太大。4、G＋Ｃ含量在４０%~60％之间，45-５ 5%最佳。ﻫ5、碱基要随机分布,尽量均匀.ﻫ6、引物自身不能有连续 4 个碱基得互补.ﻫ7、引物之间不能有连续 4 个碱基得互补。８、引物 5′端可以修饰。ﻫ９、3′端不可修饰,而且要避开Ａ T，GC ri ｃ h 得区域,避开Ｔ／C,A/G 连续结构(2-3 个）。10、 引物 3′端要避开密码子得第 3 位。11、引物整体设计自由能分布 5‘端大于３’端，且３‘端自由能最好小于 9 Ｋ J/mo ｌ。可用 o ｌ igo 6 软件进行比对瞧结果得情况。ﻫ1２、做荧光定量产物长度 8 ０—１ 50ｂ p 最好，最长就是 3 ０ 0bp、１３、引物设计避开 DNA 污染，最好跨外显子接头区.14、引物与非特异性扩增序列得同源性最好小于 70％或者有 8 个互补碱基同源。ﻫ1５、查瞧有无假基因得存在。假基因就就是无功能得 DNA 序列，与需要扩增得目得片段长度相似.1 ６、T Ｍ值在５８-62 度之间.ﻫ17、引物设计得软件Ｐ rim ｅ r 5、0 有专门针对荧光得。设计得目得就是在两个目标间取得平衡：扩增特异性与扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化得预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意得基本原理：① 引物长度 一般引物长度为 18~30 碱基。总得说来,决定引物退火温度（Tm 值)最重要得因素就就是引物得长度。有以下公式可以用于粗略计算引物得退火温度。 在引物长度小于 20bp 时：[4（G+Ｃ）＋2(A+T)］－5℃ 在引物长度大于 2 ０ b ｐ时：６２、3℃+０、41℃(%G—C)—５０ 0／l ｅ ngth—5℃ 另外有许多软件也可以对退火温度进行计算,其计算原理会各有不同，因此有时计算出得数值可能会有少量差距。为了优化 PCR 反应，使用确保退火温度不低于 54℃得最短得引物可获得最好得效率与特异性。 总得说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高４倍，这样，大多数应用得最短引物长度为 1 ８个核苷酸。引物长度得上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵得原因，引物越长,它退火结合到靶 DNA 上形成供 D Ｎ A 聚合酶结合得稳定双链模板得速率越小。 ② G...
