PEG-ceramide 纳米胶束诱导 N2a 细胞自噬降解 Tau 蛋白的讨论阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种临床常见的神经退行性疾病,以记忆力下降、行为异常、学习功能及社交功能障碍为主要临床表现,占全部老年期痴呆的 80%左右。其主要病理机制是淀粉样 β 蛋白聚集和 Tau 蛋白的异常磷酸化,许多其他因素以复杂的方式促成 AD 的病理进展。自噬(Autophagy)是细胞正常的,调节性的回收衰老成分,清除结构或功能异常细胞器或蛋白聚合物的细胞生理过程。在神经系统退行性疾病中,细胞自噬能力下降,导致异常沉积或者错误折叠的蛋白质无法被有效清除,引起相应临床症状。目前有许多讨论表明小分子活性物质可以诱导细胞自噬达到清除细胞过表达蛋白的目的,但对于中枢系统,血脑屏障的存在使得绝大部分分子无法顺利入脑,发挥效益,而纳米医学的出现给予了脑靶向治疗策略新可能,部分纳米材料被证实可以诱导细胞自噬的发生。在过去的讨论中,我们制备了一种稳定且低毒的纳米药物载体——PEG-ceramide 纳米胶束,国内外目前未有相关讨论探讨其潜在治疗 AD 的可能性,基于此,我们假设这种新型纳米材料可能通过诱导细胞自噬而清除过表达的 Tau 蛋白。在第一部分实验,我们通过薄膜分散法,进一步优化处方,成功制得稳定的空白 PEG-ceramide 纳米胶束,并测定其粒径及 Zeta 电位。其次建立了 N2a 细胞的培育方法,构建体外神经系统模型,并通过 CCK8 法考察 PEG-ceramide 纳米胶束的细胞毒性。第二部分实验,我们采纳经典的 Western Blot 方法检测 PEG-ceramide 纳米胶束对 N2a 细胞自噬相关蛋白 LC3 及自噬底物蛋白 p62 含量的影响,推断其对细胞自噬水平的影响。结果显示 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比例升高,p62 表达水平下降,提示自噬活化。其次我们采纳目前主流的细胞自噬流检测方法,使用表达 mRFP-GFP-LC3 融合蛋白的病毒感染细胞,并标记及追踪 LC3,共聚焦显微镜观察细胞荧光表达。结果提示 PEG-ceramide 纳米胶束处理的 N2a 细胞自噬小体及自噬溶酶体斑点明显增多,呈现增强的自噬流趋势。第三部分实验,我们通过质粒转染,使 N2a 细胞表达 WT-Tau 及 P301L-Tau 两种人类 Tau 蛋白,然后采纳 Western Blot 方法检测 PEG-ceramide 纳米胶束对细胞内 LC3 及 Tau 蛋白水平的影响。结果显示 PEG-ceramide 纳米胶束可以增加细胞 LC3-Ⅱ/Ⅰ 的比例,激活自噬,同时下调细胞内 WT-Tau 及 P301L-Tau 的含量。综上,我们初步证实 PEG-ceramide 纳米胶束可以增强细胞的自噬及自噬流,并可能通过调节自噬的途径降解 N2a 细胞中过表达的的人 Tau 蛋白含量。随着讨论进一步的深化,我们信任这种纳米胶束可在未来用于 AD 的诊疗策略之中。
