实验二：细菌的简单染色和革兰染色一、实验目的1.掌握细菌涂片的制备方法。2.掌握细菌简单染色和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。3.巩固显微镜油镜的使用方法。4.学习无菌操作技术。二、实验原理1、染色原理：细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采纳带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。2、革兰染色法原理：革兰染色法可根据细菌细胞壁结构和成分的不同，将其分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。另外，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果。如酵母菌细胞壁的成份完全与细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。三、实验仪器，材料和用具1、仪器及用具：显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、镜油、无菌牙签2、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、牙垢、未知菌 S1 和 S33、试剂：结晶紫染液、革氏碘液、洗脱液（95%乙醇溶液）、番红染液四、实验步骤（1）简单染色1、载玻片的处理：用纱布将取出的载玻片擦干，把要涂菌的部位在火焰上烤一下，冷却待用。2、涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在干净无脂的载玻片上涂一直径约 2mm 的均匀薄膜。3、干燥：涂片后待其自然干燥。4、固定：将以干燥好的涂片标本朝上，在酒精灯火焰上通过 2~3 次，要求载玻片温度不能超过 60 度，以手背触载片不烫为宜。5、染色：滴加一滴结晶紫染液，染色 1min。6、水洗：用水将染液洗去，再用吸水纸将水吸干。7、镜检（2）革兰染色1~4 步与简单染色相同。5、初染：滴加一滴结晶紫染液，染色 1min。而后水洗，吸干。6、媒染：加一滴碘液覆盖涂片 1min，水洗，吸干。7、脱色：滴加洗脱液，轻轻摇动载玻片，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，吸干。整个脱色过程约 20~30 秒。8、复染：滴加番红染液复染 3min，水洗，吸干。9、镜检：盖上盖玻片，从低倍镜到油镜依次观察...
